| 通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用 |
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| 引用本文： | 肖素勤,孙振,王莎莎,梁锋,李莉,年洪娟,李昆志,陈丽梅.通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用[J].生命科学研究,2011,15(6):476-484. |
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| 作者姓名： | 肖素勤 孙振 王莎莎 梁锋 李莉 年洪娟 李昆志 陈丽梅 |
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| 作者单位： | 昆明理工大学生物工程技术研究中心,中国云南昆明,650500 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金资助项目(30670163); 云南省中青年学术与技术带头人培养费资助项目(2004PY01-5) |
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| 摘 要： | 为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.
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| 关 键 词： | pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体 通路克隆(Gateway)技术 光诱导型启动子 植物表达载体 叶绿体定位 |
Construction and Application of a Gateway Entry Vector pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~* |
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| XIAO Su-qin
,
SUN Zhen
,
WANG Sha-sha
,
LIANG Feng
,
LI Li
,
NIAN Hong-juan
,
LI Kun-zhi
,
CHEN Li-mei.Construction and Application of a Gateway Entry Vector pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*[J].Life Science Research,2011,15(6):476-484. |
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| Authors: | XIAO Su-qin SUN Zhen WANG Sha-sha LIANG Feng LI Li NIAN Hong-juan LI Kun-zhi CHEN Li-mei |
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| Institution: | XIAO Su-qin,SUN Zhen,WANG Sha-sha,LIANG Feng,LI Li,NIAN Hong-juan,LI Kun-zhi,CHEN Li-mei*(Biotechnology Research Centre,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,Yunnan,China) |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3 Gateway technology light inducible promoter plant expression vec-tor chloroplast location |
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