绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（＋），构建重组质粒pET-egl3，转化到大肠杆菌BL21（DE3）。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化，纯化后酶比活力达到6u／mg蛋白，最适反应温度为60℃，最适pH为4．0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变，各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F，其比活力为野生型EGⅢ的2．8倍和3．45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍，催化效率Kcat提高了5．4倍；而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4．4。