| 用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系北大核心CSCD |
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| 引用本文： | 綦世金,毕延震,刘西梅,华文君,郑新民,李奎,唐中林,华再东,陈彬.用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系北大核心CSCD[J].中国生物化学与分子生物学报,2017(3):311-318. |
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| 作者姓名： | 綦世金 毕延震 刘西梅 华文君 郑新民 李奎 唐中林 华再东 陈彬 |
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| 作者单位： | 1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室550025;2.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室550025;3.贵州大学动物科学学院550025;4.湖北省农业科学院畜牧研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室430064;5.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所100193; |
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| 基金项目： | 转基因生物新品种培育重大专项(No.2016ZX08006001-005；No.2016ZX08006002-006；No.2016ZX08010003-006)；湖北省科技支撑计划(No.2014BBB010)；湖北省农业科技创新中心(No.2016-620-000-001-027)；湖北省农业科学院青年基金(No.2016NKYJJ19)；湖北省农业科学院竞争性项目(No.2016 jzxjh013)资助~~ |
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| 摘 要： | 肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。
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| 关 键 词： | 猪肌肉抑制素双等位基因敲除 CRISPR/Cas9 Cre/Lox P重组酶删除系统 |
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