| PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达 |
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| 引用本文： | 陈长源,郑兴,徐荣良,胡建强,秦永文.PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达[J].现代生物医学进展,2010,10(8). |
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| 作者姓名： | 陈长源 郑兴 徐荣良 胡建强 秦永文 |
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| 摘 要： | 目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达.方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆.经筛选阳性表达克隆并测序验证后,Pacl酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒.病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞.用Western blot技术检测PRKAG2蛋白的表达.结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108 pfu/ml.荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达.结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础.
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| 关 键 词： | PRKAG2基因 突变 腺病毒载体 AMPK |
Construction of Ad-PRKAG2 G100S-EGFP Vector and Its Expression in Myocardial Cells |
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| CHEN Chang-yuan,ZHENG Xing,XU Rong-liang,HU Jian-qiang,QIN Yong-wen.Construction of Ad-PRKAG2 G100S-EGFP Vector and Its Expression in Myocardial Cells[J].Progress in Modern Biomedicine,2010,10(8). |
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| Authors: | CHEN Chang-yuan ZHENG Xing XU Rong-liang HU Jian-qiang QIN Yong-wen |
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