应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

本研究旨在应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）小鼠（DCM小鼠）进行探索性治疗，尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式，为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒，把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中，通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示，gRNA 2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高，达到80%（P<0.0001）。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中转导出生后1天的DCM小鼠原代心肌细胞，Q-PCR检测结果表明CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA的敲低效率达到55%（P<0.01）。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中，然后将200 μL 约1×1012 AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内，待注射小鼠发育至5月龄时，Q-PCR检测结果显示，AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%（P<0.01）。对5月龄野生型（WT）、DCM（未注射病毒组）和AAV9+DCM（基因组编辑工具注射组）三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示：DCM小鼠的心脏形态异常，而AAV9+DCM小鼠心脏形态趋于正常；对三组小鼠的心脏进行超声心动图并对心功能指标进行统计发现，DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数（left ventricular percent ejection fraction，LV EF%）、左心室短轴缩短率（left ventricular percent fractional shortening，LV FS%）分别下降了50.4%（P<0.0001），55.1%（P<0.0001），而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升了66.5%（P<0.01），77.0%（P<0.01）；通过Q-PCR和天狼星红染色检测三组小鼠的心脏纤维化程度，结果显示DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因，分别高表达5.2倍（P<0.001）、4.5倍（P<0.01），而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降了2.0倍（P<0.05）、1.4倍（NS），天狼星红染色结果显示纤维化区域明显下降；通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测三组小鼠的心脏心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平，结果表明DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍（P<0.01），而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降下降2.8倍（P<0.05），Nppa蛋白质表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变（gRNA 5T）和正常的TNNT2 mRNA（gRNA 5V）序列分别组合转染到293T细胞中，通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示，gRNA 5T序列表达效率为30%（P<0.0001），而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141W mRNA的gRNA，特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA，有效改善了转基因小鼠的心功能，为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。

Restriction Endonuclease Cleavage Map of Goose Liver Mitochondrial DNA

The mitochondrial DNA (mtDNA) of goose liver (from single animal) is a circular DNA molecule with 16.45x103 base pairs. The restriction endonuclease cleavage map of this mtDNA, using six different restriction enzymes, is reported here. The sites are as follows: 1 for SalI, BgIII; 2 for BamHI; 3 for EcoRI; 4 for BglI and 5 for HindIII. The fragments corresponding to 16 cleavage sites were ordered and precisely located. The position of D-loop and the direction of replication of the mtDNA were also determined.