有机溶剂和抑制剂对毕赤酵母表达TpmD酶活性影响

摘要：【目的】本文在利用毕赤酵母成功分泌表达高活性三苯基甲烷类染料降解酶TpmD的基础上，研究不同有机溶剂和常见酶抑制剂对纯化后的重组脱色酶TpmD活性的影响。【方法】 将毕赤酵母分泌表达的重组酶TpmD经超滤浓缩及镍离子亲和层析柱纯化后得到纯化的重组TpmD酶。利用分光光度计法测定其对孔雀石绿脱色活性，并研究了各种有机溶剂和抑制剂对TpmD酶脱色活性的影响。通过脱色过程溶氧测定和全波长扫描分析反映了DTT与NADH作为TpmD辅因子时对孔雀石绿脱色反应的表观区别。【结果】甲醇对酶活性抑制作用较弱，重组酶在甲醇中能维持约90%的活性，乙醇和丙酮则使重组酶活性则迅速丧失。低浓度二甲基亚砜有利于重组酶活性的维持，30%的二甲基亚砜可抑制一半以上酶活性。L-半胱氨酸、叠氮化钠及低浓度的EDTA对重组酶活性影响较小，较高浓度的EDTA才显示较强抑制作用；表面活性剂SDS有强烈的抑制作用，极低的浓度也能完全抑制重组酶活性。抗氧化剂二硫苏糖醇（DTT）对重组脱色酶的作用十分独特，它可替代NADH辅助脱色反应并增加脱色速率，但在反应终点脱色总效率约为NADH作为辅酶时的92%。DTT辅助TpmD脱色孔雀石绿过程中的耗氧情况及脱色产物与NADH作为辅酶时明显不相同。【结论】发现不同有机溶剂和常见抑制剂对重组酶活性的影响存在较大差异，首次证实DTT能辅助TpmD脱色反应，这一脱色反应过程的作用机理与NADH为辅酶催化的反应原理完全不同。

Effects of organic solvents and inhibitors on the decolorization activity of TpmD expressed in Pichia Pastoris