建立转酮酶酶活测定方法及应用

摘要：目的 转酮酶是非氧化磷酸化戊糖途径中的关键酶。5-磷酸木酮糖是分析测定转酮酶酶活性的底物，然而因该底物难以化学合成，生产成本高，从而导致厂家停止生产，目前市场上无法得到。因此有必要建立起新的转酮酶酶活测定方法。方法 （1）将酿酒酵母的木酮糖激酶基因（XKS1）克隆于pET30a载体。（2）纯化木酮糖激酶。（3）建立酶偶联反应，以木酮糖为底物，将其转化为5-磷酸木酮糖，用于转酮酶酶活的测定。结果 （1）成功地将XKS1基因克隆于pET 30a得到质粒pXZ-X004。（2）质粒pXZ-X004诱导表达产生C端His-tag标签的XK，用Ni柱分离得到纯化的木酮糖激酶(XK)。（3）纯化的XK活性为21.0 U/mg protein，当用12.5%的甘油保存于?80 ℃环境1个月，仍有74%的活性。（4）用纯化的XK建立了转酮酶（TK）酶活测定新方法，当TK酶活低至0.00875 U时仍能够利用新方法检测。结论 本实验通过克隆和表达XKS1基因，成功地建立了TK酶活性测定的新方法，并应用于木糖代谢工程菌株TK酶活的测定，为医学和生态学领域中TK酶活的分析奠定了基础。

Establish and application of the assay for determining transketolase activity