转录激活因子1(ATF1)内部核糖体进入位点的鉴定及活性分析

蛋白质翻译起始通常有两种机制，一是依赖帽结构的翻译，另一种是依赖5′非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES).在后一种方式中，在某些IRES反式作用因子，如La蛋白、多聚嘧啶串结合蛋白1等的参与下，直接招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点，启始翻译.研究发现，参与细胞生长、分化、细胞周期进程、凋亡和压力调控的相关蛋白中通常含有IRES元件.基于功能，我们提出假说：转录激活因子1(ATF1)的5′-UTR可能具有IRES活性.为验证假说，首先构建了含全长ATF1 5′-UTR的双荧光素酶报告质粒|质粒转染结合报告酶活性分析显示，ATF1 5′-UTR在Bel7402、HCT-8和HEK293细胞中表现出不同的IRES活性|而此IRES活性与5′-UTR中的隐藏启动子无关.同时还发现，ATF1 5′-UTR在NIH3T3细胞中却没有IRES活性.与此结果相一致，Western印迹检测ATF1在这几种细胞系中的表达.结果显示，Bel7402、HCT 8和HEK293中ATF1蛋白质表达水平较高，而在NIH3T3中却极低. ATF1 5′-UTR的系列5′-删除突变及报告酶分析证明，ATF1 5′-UTR的完整性对其IRES活性大小发挥重要作用|其中5′端的204 bp序列对其IRES活性贡献较大. RNA-蛋白免疫共沉淀实验揭示，ATF1 5′-UTR可与La和PTBP1蛋白结合|抑制La和PTBP1蛋白质的表达，并可减低HEK293细胞中ATF1蛋白质表达水平.这些结果提示，La和PTBP1蛋白（两种ITAFs）为ATF1 5′-UTR发挥IRES活性所必需.总之，上述结果证明，ATF1 5′-UTR具有IRES活性，其活性发挥依赖与La和PTBP1蛋白的结合.上述发现为进一步研究La和PTBP1表达及亚细胞定位对ATF1 IRES调控机制的影响奠定了基础.

Structural and Functional Analyses of the Core Internal Ribosome Entry Site region of ATF1 5′-UTR