蒺藜苜蓿MtbHLH148转录因子的克隆与转化及其功能分析

bHLH(Basic helix loop helix, bHLH)转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一，广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制。该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的MtbHLH148基因，采用qRT PCR方法分析MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿中的表达特性，构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究。结果显示：(1)从蒺藜苜蓿中获得MtbHLH148基因，该基因cDNA全长1 343 bp，包含开放阅读框为603 bp，编码 201 个氨基酸，蛋白分子量22.7 kD，等电点为11.76；蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域，无信号肽，为亲水性蛋白；含有精氨酸／赖氨酸残基的保守结构域和典型的bHLH结构域；二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。(2)亚细胞定位表明，MtbHLH148蛋白定位在细胞核。(3)进化树分析表明，MtbHLH148与大豆(Glycine max)的亲缘性最近；启动子分析发现，该基因启动子区域含有光响应元件、MYB结合位点以及ABA应答元件ABRE，可能参与非生物胁迫。(4)qRT PCR分析发现，MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高，叶中表达量最低，且MtbHLH148基因受ABA(100 μmol/L)诱导并在盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理8 h内表达量上调，而在低温(4 ℃)处理时表达量明显下调。(5)成功构建超表达载体pCAMBIA3301 MtbHLH148并转化拟南芥获得16个抗性株系，经鉴定有12个过表达株系，其中表达量最高的转基因株系为OE8；对OE8株系耐盐性功能分析发现，转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型，盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的1.5倍，表明其耐盐性得到了增强。研究表明，MtbHLH148基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用。