花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白（PR蛋白），容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸 （Salicylic Acid，，SA）对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理，提取RNA利用 Real-time PCR技术检测β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量。结果表明经诱导后24h，β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高，是未经SA诱导的1.8倍。根据花生β-1,3-葡聚糖酶基因 cDNA序列（GenBank JQ801335）设计三个嵌套的5＇端特异引物，以花育20号基因组DNA为模板，利用TAIL-PCR方法扩增得到973bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因上游启动子片段, ，命名为Ah-Glu-Pro，，在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400。PLACE 和 PlantCARE 启动子在线预测分析表明，Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件，还含有病原菌及SA响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物，采用普通PCR法从花育20号基因组中扩增得到931bp的启动子序列，命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子，构建植物表达载体 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P 转化洋葱表皮细胞，经5.0 mmol/L SA诱导处理48h后进行GUS染色。结果表明：经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS染色显示为蓝色，未经诱导的洋葱表皮细胞GUS染色未显示蓝色，说明Ah-Glu-P是一个诱导型的启动子，可能含有对SA响应的顺式调控元件。