人微小RNA-302s表达载体的构建及其对细胞周期的影响

PCR扩增人miR-302s的启动子区和编码区,亚克隆至pEGFP-C1载体,构建miR-302s重组表达载体pEGFP-C1-miR-302s。经过测序鉴定该载体含有核心启动子区(TATA)和miR-302s(miR-302a、miR-302a~#、miR-302b、miR-302b~#、miR-302c、miR-302c~#、miR-302d、miR-367和miR-367~#簇)的编码子。荧光素酶报告基因实验结果显示pEGFP-C1-miR-302s转染HEK293细胞后抑制细胞周期相关基因cyclin D1和PCAF 3′UTR的活性,提示cyclin D1和PCAF是miR-302s的靶基因。pEGFP-C1-miR-302s转染HEK293细胞后,Real-time Q-PCR检测发现miR-302s高表达,Westernblot分析发现cyclin D1和PCAF的表达降低,流式细胞术分析进一步表明细胞转染后细胞周期G_1期缩短,S期延长,表明miR-302s对细胞周期G_1-S期转换具有重要调节作用。