| 摘 要： | 苹果酸酶(malic enzyme,ME)普遍存在于各种生物体中,在二价阳离子(Mg~(2+)或者Mn~(2+))的存在下,它可以催化L-苹果酸进行氧化脱羧反应,产生丙酮酸、CO_2和NADPH。前期分析结果预测红冬孢酵母YM25235菌株具有2个苹果酸酶同功酶基因RKME1和RKME2,而且RKME1基因在15℃低温条件下mRNA转录水平显著提高。为了验证RKME1的结构与功能,以红冬孢酵母YM25235 cDNA为模板,PCR扩增得到大小为1 623 bp的开放阅读框,共编码540个氨基酸。序列分析结果显示该序列含有苹果酸酶保守的4个结构域(Ⅰ~Ⅳ),同源建模结果显示该序列的三级结构和蛔虫中的苹果酸酶晶体结构有较高相似性且高度保守。进一步将RKME1插入到载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32a-RKME1,然后导入大肠杆菌BL21中进行表达。经IPTG诱导,获得了相对分子质量约为70 kD的蛋白质条带。将该蛋白质进行镍柱亲和层析纯化后,酶活分析的结果表明,重组表达的RKME1蛋白可催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,酶活为160 U/mg以上。上述结果表明,RKME1是一个新的苹果酸酶基因,这为深入研究苹果酸酶与红冬孢酵母低温条件下生长适应性之间的关系奠定了基础。
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