蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH 中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH 的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH 是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand 法测得比活为100。蛇肌GAPDH 的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH 消光系数E_(280)~(0.1)%为0.775;Holo-GAPDH 的消光系数E_(280)~(01.)为1.02。蛇肌GAPDH 对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-8)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH 结合后有Racker 带,每分子蛇肌GAPDH 可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GA PDH 的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH 在285nm 处有一负峰,292nm、270nm 处有肩。加入NAD 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH 在220nm 处有一负峰,208nm 处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。