热量限制通过HNF3γ下调NOX4表达来抑制内皮细胞的衰老

为了观察热量限制对主动脉内皮细胞中HNF3γ及NOX4基因表达的影响, 揭示HNF3γ-NOX4-活性氧通路介导热量限制抗内皮细胞衰老的分子机制, 文章将主动脉内皮细胞分为5组：对照组、高热量组、低热量组、siRNA+低热量组、siRNA+高热量组。应用逆转录实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、Western blotting分析各组HNF3γ、NOX4 mRNA及蛋白水平变化, 并检测各组细胞内活性氧产量及细胞衰老程度变化。采用染色质免疫共沉淀分析HNF3γ蛋白与NOX4基因启动子区域结合情况, 萤光素酶报告基因检测HNF3γ蛋白结合后对NOX4基因启动子活性的影响。结果显示：与对照组比较, 低热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著升高(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著降低(P<0.05); 高热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著降低(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著升高(P<0.05); siRNA+低热量组及siRNA+高热量组中NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧水平及细胞衰老程度显著升高(P< 0.05)。染色质免疫共沉淀证实HNF3γ蛋白可与NOX4基因启动区域4个结合位点(-6 bp、-76 bp、-249 bp、-954 bp)结合。萤光素酶报告基因检测显示HNF3γ蛋白与NOX4启动子区域1个位点(-6 bp)、2个位点(-6、-76 bp)、3个位点(-6、-76、-249 bp)、4个位点(-6、-76、-249、-954 bp)结合, 可使NOX4启动子活性分别降低至对照组的80.15±4.64%、40.02.±2.15%、16.46±2.24%、12.13±1.46%, P<0.05。上述结果提示热量限制可上调HNF3γ基因表达, 增强HNF3γ蛋白活性, 促进HNF3γ蛋白同NOX4基因启动子区域结合, 抑制NOX4基因表达, 进而减少细胞内活性氧产生而延缓动脉内皮细胞衰老。