利用dCas9-FokI编辑大鼠Dnmt1基因

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而，该系统在提供靶向性基因修饰的同时，会产生一些不需要的突变，即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性，我们将野生型FokI核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合，形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶，在本研究中，通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端，构建表达质粒pST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中，发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时，存在显著的脱靶现象。以此为基础，我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因，研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠ mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中，用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植，最终获得43只F0代大鼠，其中两只在靶点位置包含突变，突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析，结果显示，无脱靶现象存在。综上，表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因，并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统，基因编辑效率有所下降，但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。