哺乳类基因工程的一些实验操作 实验7 放射性同位素标记DNA探针

一、切3移位（Nick translation)标记 DNAI. 配制试剂(1) 10XNT（切口移位）缓冲液：50mMMgCI21 0.1M R-M,基乙醇10.5m Tris·HCI pH7.8/0.，毫克1 毫升小牛血清白蛋白。 (2)2XAct缓冲液：20tnM Tris·HCl PH7.5/ JOmM MgCI,/2毫克/ 升小牛血清白蛋白。 (3) 1:4000 DNasel ＾液：1毫克DNase I/ I,升lomm HCI. B液：取人液5微升，加2XAc。液22.5微升和双 重蒸馏水22.5微克， 终体积为50微升（DNase I 1:10)0 取B液1.25微升，加498.75微升2 X Act缓冲 液。终体积为500微升（DNase 11:4000)a (4) dATP, dTTP, dCTP和dGTP各用重蒸水 配成2mM。体积1毫开。 2． 标记放射性同位素的反应按下列次序在 Eppendorf离心管中加入试剂：DNA探针（0.1-1.0 微克）z微升；IOXNT缓冲液2.5微升；dATP 1.5 微升；dG'TP 1.5微升；dTTP 1，，微升；ddH,0 y微 升；。一，'P-dCTP (3,000居／米摩(mmol), 10微居／微 米）5微升；DNase I (1:4 , 000)Ci/mmol, 0.5-1微 升。使总体积为25微升。置冰上1小时，加DNA多 聚酶I，单位，14℃水浴1-1.5小时，加0.2M EDTA 2.5微升终止反应。