| 摘 要： | 建立高效液相色谱(HPLC)-肽图分析方法,用于抗人CD52单克隆抗体的专属性鉴别。抗CD52单抗样品经盐酸胍变性、DTT还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷基化。超滤置换酶切缓冲液后进行胰蛋白酶酶切并终止。色谱条件:采用Eclipse XDB-C18 4.6×250 mm 5μm(Aglient)色谱柱,0.1%TFA水溶液与0.1%TFA乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为214 nm,柱温为30℃;质谱条件:分析时长135 min;检测方式正离子,TOF;MS+扫描范围350-1 500 Da;Product Ion+扫描范围100-1 500 Da;质谱分辨率40 000;Exceeds,150 Cps。CD52单抗重链CDR1、CDR3、轻链CDR1对应肽段由质谱鉴定出。HPLC-肽图方法专属性验证显示辅料制剂及异种抗体对检测结果无干扰;精密度验证结果显示目标峰的峰面积RSD%均在1.7%-7.6%之间。且目标峰的保留时间RSD%均在0.1%-0.2%之间,小于5%的可接受标准;耐用性结果显示,3μg胰蛋白酶、37℃和18 h的酶切条件是最合适的样品处理条件。基于CDR相关肽段鉴别的HPLC-肽图分析方法可定性鉴定出抗CD52单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人CD52单抗的专属性鉴别并可用于质量控制及批检验放行。
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