| 摘 要： | 目的:探索并确定甘精胰岛素的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的甘精胰岛素肽图分析方法。方法:采用0.4 mol/L Tris-HCl(pH9.0)溶液作为酶解缓冲液,V8蛋白酶与甘精胰岛素之比为1 U∶10μg,于37℃反应1 h后加入磷酸终止反应,采用RP-HPLC分离目标肽段,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法鉴定酶解产生的肽段。结果:甘精胰岛素基本完全酶解,未消化的主成分较《欧洲药典》9.5版(EP9.5)方法大幅减少,时间缩短了1/2,酶解的完全性与有效性大幅提高。产生的4个目标肽段可通过RP-HPLC清晰呈现并有效分离,肽段Ⅱ和Ⅲ的分离度大于25.0,拖尾因子均小于1.5,且各肽段与对照品的相对保留时间在1.00±0.01范围内。4个目标肽段和2个非特异肽段均由质谱鉴定出。较好地克服了现行EP9.5甘精胰岛素分析方法酶解反应的完全性较差、非特异酶解肽段含量较高、理论目标肽段Ⅳ及Ⅰ含量过低等不利于表征目标肽段并确证其氨基酸序列正确性的缺陷。选取B32脱精氨酸甘精胰岛素评价方法的专属性,证实本方法专属性良好;6次重复测定各肽段的保留时间及峰面积的RSD为0.05%～0.20%,考察不同实验人员在不同时间处理样品得到结果的变异程度,RSD为0.01%～0.36%,表明方法的中间精密度较好。V8酶量为15～25 U、柱温为38～42℃、采用3个不同厂家的色谱柱时测定的相对保留时间的RSD为0.12%～0.26%,表明方法的耐用性较好。酶解后的样品于6℃存放24 h及-20℃储存7 d,稳定性较好。结论:实现了甘精胰岛素主成分的高效特异酶解及目标肽段的有效分离,该方法专属性、重复性、中间精密度及耐用性均表现良好,可用于甘精胰岛素的结构确证及专属性鉴别。
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