| 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力 |
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| 引用本文： | 程新宽,陈曦,冯进辉,吴洽庆,朱敦明.内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力[J].微生物学通报,2020,47(7):2119-2127. |
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| 作者姓名： | 程新宽 陈曦 冯进辉 吴洽庆 朱敦明 |
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| 作者单位： | 1 天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室天津 300457;2 中国科学院天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室 天津市生物催化技术工程中心天津 300308 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金(21778072)；天津市科学技术委员会项目(15PTCYSY00020, 15PTGCCX00060)；天津市教委科研计划(2019KJ239) |
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| 摘 要： | 【背景】高效实现D-氨基酸的生物合成一直是人们关注的热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,DAPDH)能够直接催化2-酮酸和氨合成D-氨基酸。【目的】提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,并解释其催化机制。【方法】以来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacteriumthermophilum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)为模板,在前期结构分析结合被选择位点突变结果的基础上,确定对H227位进行定点饱和突变,并以D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-谷氨酸为底物进行筛选。【结果】获得突变体H227Q和H227N。突变体H227Q对丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-酮戊二酸的比活力比野生型分别提高了10.9、11.5、8.6和7.6倍。动力学参数表明,突变体H227Q同时提高了酶对底物的亲和力及催化常数,使其对丙酮酸的催化效率(k_(cat)/K_m)相较于野生型提高了9.4倍。利用分子模拟技术分析突变体H227Q与产物氨基酸之间的相互作用表明,227位的谷氨酰胺通过与氨基酸的羧酸形成氢键,使得氨基酸产物Cα上的氢和辅酶烟酰胺环C4原子之间的距离缩短。【结论】利用定向进化技术提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,有助于开发新型的高效生物催化剂,这些工作也为下一步继续进行更具挑战性的D-氨基酸研究提供了基础。
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| 关 键 词： | 烷基取代2-酮酸，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶，饱和突变，分子对接，D-氨基酸 |
Mutation of a key amino acid residue of meso-diaminopimelate dehydrogenase enhances the catalytic activity toward alkyl substituted 2-keto acids |
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| CHENG Xin-Kuan,CHEN Xi,FENG Jin-Hui,WU Qia-Qing,ZHU Dun-Ming.Mutation of a key amino acid residue of meso-diaminopimelate dehydrogenase enhances the catalytic activity toward alkyl substituted 2-keto acids[J].Microbiology,2020,47(7):2119-2127. |
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| Authors: | CHENG Xin-Kuan CHEN Xi FENG Jin-Hui WU Qia-Qing ZHU Dun-Ming |
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| Institution: | 1 Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education; Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology; College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China;2 Tianjin Biocatalysis Technology Engineering Center; National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Alkyl substituted 2-keto acid Meso-diaminopimelate dehydrogenase Saturation mutation Molecular docking D-amino acids |
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