花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，其种子中富含油酸和亚油酸。△^12脂肪酸脱氢酶（FAD2）是亚油酸合成的关键酶，催化油酸（18：1）在△^12位上脱氢生成亚油酸（18：2），但由于△^12脂肪酸脱氢酶本身的特性，目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究，尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△^12脂肪酸脱氢酶基因（GenBank接受号为AY1006）构建高效表达载体，把花生△^12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中，构建了pRSET／HO-A融合表达载体，并转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）pLysS中，在IPTG诱导下，pRSET／HO-A融合表达载体在BL21（DE3）pLysS菌株中高效表达了△^12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白，同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后，进行脂肪酸甲酯化处理，通过气相色谱（GC）和气相色谱，质谱（GC-MS）分析表明，所编码的酶具有△^12脂肪酸脱氢酶的活性，能将外源性的底物油酸转化为亚油酸，转化率为11．8％。花生△^12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导，本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。