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| pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建 | |
| 引用本文： | 李瑗春,茹懿,王秦豪,李霞,白庆咸. pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建[J]. 现代生物医学进展, 2013, 13(8) |
| 作者姓名： | 李瑗春 茹懿 王秦豪 李霞 白庆咸 |
| 作者单位： | 1. 第四军医大学西京医院血液内科 陕西西安710032;第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西西安710032 2. 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西西安710032 3. 第四军医大学西京医院血液内科 陕西西安710032 |
| 摘 要： | 目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础.方法:pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-).首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheⅠ/XhoⅠ之间；接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnⅠ/ HindⅢ之间,最后XhoⅠ/KpnⅠ双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可.酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达.pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp.第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp.第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-l+2,以Bcl和Kpn Ⅰ分别酶切pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-l+2置换入pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL.结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1 (-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论:成功构建pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础. |
| 关 键 词： | pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒 重组质粒 CML 分段PCR |
Construction of the Eukaryotic Expressing Vector of Human Bcr-Abl and Bcr-AblT315I |
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