FGFR2Ⅲc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达 |
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引用本文: | 郭淑军,万艳,李丽玲,秦丽,陈小佳.FGFR2Ⅲc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达[J].中国生物工程杂志,2011,31(5). |
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作者姓名: | 郭淑军 万艳 李丽玲 秦丽 陈小佳 |
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作者单位: | 1. 国家教育部基因组药物工程研究中心广东省生物工程药物重点实验室,暨南大学生物工程研究所,广州,510632 2. 国家教育部基因组药物工程研究中心广东省生物工程药物重点实验室,暨南大学生物工程研究所,广州,510632;深圳南山区慢性病防治院,深圳,518000 |
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摘 要: | 目的:构建人FGFR2Ⅲc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2Ⅲc的重组细胞株,初步研究FGFR2Ⅲc对L6细胞的作用.方法:从人胎盘组织中获得FGFR2Ⅲc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2Ⅲc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2Ⅲc.将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2~4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株.RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2Ⅲc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系.结果:构建了舍人FGFR2Ⅲc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2Ⅲc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化.结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2Ⅲc的重组L6细胞株,FGFR2Ⅲc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2Ⅲc基因与成肌分化功能相关性奠定基础.
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关 键 词: | 成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc 慢病毒表达系统 大鼠肌原细胞 |
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