彻底清除转化体中野生型DNA的专一位点诱变方法

我们设计了一种高效的专一位点诱变方法，可从混合体中清除野生型ＤＮＡ。并将所需突变ＤＮＡ转入被转化细胞中，如此合成了与一种ＤＮＡ分子目标序列一致的并带有能产生限制性内切酶位点的插入突变的两条互补的寡核苷酸链。利用野生型ＤＮＡ分子中的两端各有两个限制性位点的一段目标ＤＮＡ片段作为模板，上述合成的两种寡核苷酸引物被延伸、富集并分离。被延伸的产物在聚合酶链式反应中又反过来被用作模板，以获得突变的双链ＤＮＡ片段，此片段通过其两端的限制性位点能很方便地用侧面限制性内切位点克隆到质粒中去。用这些质粒转化的大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）细胞可进行大量的分析。通过集落杂交试验、限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，得知这些转化体百分之百含有突变型的ＤＮＡ序列。