农杆菌介导的马尔尼菲青霉基因转化技术的建立及优化

目的建立农杆菌介导的马尔尼菲青霉(PM)基因转化技术,并对该技术条件进行优化。方法以二元质粒p DHt/SK为载体,通过农杆菌介导将pyr G基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株SPM4(pyr G-,nia D-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子。运用PCR验证重组子。进一步对影响转化效率的农杆菌类型、共培养浓度、转化媒介、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等六个条件进行优化。结果 PCR验证pyr G基因成功的插入SPM4中,所得到转化子可稳定传代,通过条件优化,得到转化子约300个/106个细胞。选用AGL-1,以农杆菌共培养浓度为OD600=0.8,AS浓度为200μmol/L,无膜IM固体共培养基为介质,25℃共培养48 h为最适转化条件。结论成功建立了农杆菌介导PM基因转化技术,简化并优化了转化条件,该方法可用于PM基因功能研究。