| 大鼠胎脑神经干细胞HPRT基因的敲除 |
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| 引用本文： | 李雪玲,扈廷茂,John R Morrison.大鼠胎脑神经干细胞HPRT基因的敲除[J].遗传学报,2004,31(1):51-56. |
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| 作者姓名： | 李雪玲 扈廷茂 John R Morrison |
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| 作者单位： | 1. 内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特,010021
2. Monash Institute of Reproduction and Development,Clayton VIC 3168,Australia |
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| 基金项目： | 教育部基金项目 (编号 :0 10 19)~~ |
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| 摘 要： | 根据已知大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HypoxanthineGuaninePhosphoribosylTransferase ,HPRT)基因的外显子序列 ,从大鼠HPRT基因组DNA序列的细菌人工染色体 (BacterialArtificialChromosome ,BAC)中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的 3 0kb的 5′长臂 (LongArm ,LA)和 1 7kb的 3′短臂 (ShortArm ,SA) ,并分别克隆到pSL1180和pCR2 1中。进一步构建大鼠HPRT基因打靶载体———pKO HPRT ,经酶切鉴定后的大鼠HPRT基因敲除载体用NotⅠ酶切使其线性化 ,经溴乙锭、正丁醇、酚、酚 /氯仿提纯后 ,将终浓度调至 1μg μl。在FuGene 6转染试剂的作用下转染培养 2 4h的第二代大鼠胎脑神经干细胞 (RatFetalNeuralStemCells,rFNSCs)。转染后的细胞用 80 μg mlG4 18和 0 2 μmol L的Ganc全培养液筛选 ,2w后将存活细胞进行悬浮培养 ,使细胞形成球形物 ,挑选单个的球形物进行单克隆增殖 ,其中一部分细胞 (约 2～ 3× 10 3)用裂解液处理 ,取上清用于PCR检测 ,大部分细胞 (5× 10 7)用于DNA和RNA的提取 ,进行Southernbolt和RT PCR检测 ,剩余细胞冷冻保存。最后 1次实验共分离培养了 32个rFNSCs单克隆 ,其中 3个单克隆 (9 3% )经PCR、Southernbolt和RT PCR证实HPRT基因已被敲除
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| 关 键 词： | 大鼠胎脑神经干细胞 基因敲除 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 |
| 文章编号： | 0379-4172(2004)01-0051-06 |
HPRT Gene Knock-out from Rat Fetal Neural Stem Cells |
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| LI Xue-Ling,HU Ting-Mao.HPRT Gene Knock-out from Rat Fetal Neural Stem Cells[J].Journal of Genetics and Genomics,2004,31(1):51-56. |
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| Authors: | LI Xue-Ling HU Ting-Mao |
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| Institution: | LI Xue-Ling~1,HU Ting-Mao~ |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | rat fetal neural stem cells(rFNSCs) gene knock-out HPRT gene |
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