“99%难培养”微生物的概念与初步评价：以固氮菌为例

【目的】以固氮菌为例,厘清"99%难培养"的概念,定量评价土壤中可培养固氮菌的比例。【方法】直接提取土壤中所有微生物DNA,同时,利用传统微生物富集技术获得固体和液体培养基第一代和第二代菌体及其DNA,高通量测序nifH和16S rRNA基因,通过系统发育分类方法,明确固氮菌富集物的物种组成及可培养比例。【结果】文献分析表明,"99%难培养"并未有严格的定量实验证据,是"平板计数异常"的同义词,即采用显微计数法的微生物数量远高于平板计数法。针对典型旱作潮土中的固氮菌,微生物属水平的nifH基因分析发现,可培养固氮菌占比为(22.4±4.5)%–(28.4±6.3)%,而16SrRNA的结果为(31.6±3.4)%–(41.4±13)%。nifH基因分析发现土壤中固氮菌共67属,其中39属可在固体和液体培养形成菌落,但仅有4属得到显著富集,固体培养基富集了Proteobacteria门Azotobacter属,相对丰度高达(98.2±0.94)%;而液体培养基极显著富集了Firmicutes门的Paenibacillus和Clostridium属,相对丰度高达(76.7±3.9)%和(2...