| 摘 要： | 目的]构建靶向干扰内质网应激标志性因子CHOP的shRNA真核表达载体,并检测其对CHOP的干扰效率。方法]查询Gen Bank数据库,获取人源CHOP基因mRNA的序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构建靶向CHOP基因mRNA的4个特异性shRNA真核表达载体(shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4)和1个无同源性的阴性对照载体(shRNA-NC),经PCR和测序鉴定确认shRNA载体构建成功后,脂质体转染人正常肝细胞系(L-02),Western Blot法检测CHOP蛋白的表达,筛选出干扰效果最好的表达载体。结果]PCR和测序结果显示,5个shRNA表达载体均构建成功。Western Blot结果显示,0.06 g/L衣霉素损伤24h后,与内质网应激模型组相比,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组的CHOP蛋白表达水平均明显降低(P0.01),其中shRNA-1和shRNA-4组CHOP干扰效果最明显。结论]构建了并成功筛选出靶向干扰CHOP基因的真核表达载体,为深入研究CHOP介导内质网应激所致细胞凋亡的信号通路奠定了实验基础。
|
