基于双探针杂交的AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别检测方法的建立及应用

本研究目的是建立禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒4型(FAV-4)三重环介导PCR检测方法,用于3种病毒混合感染的鉴别诊断。根据GenBank数据库中AIV的HA基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列保守性,分别设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的拟南芥TOC1基因片段两端,作为报告基因,用于环介导PCR检测,成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为200bp、270bp和360bp。特异性试验结果表明,环介导PCR对含有AIV、NDV和FAV-4核酸的样品可扩增出特异性目的片段,而含有IBDV、IVB、FPV和MDV核酸的样品则未见明显扩增,特异性良好;灵敏性试验结果表明,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4的最低极限浓度分别为25pg/μL、12.5pg/μL和12.5pg/μL的核酸样品,检测灵敏度高;多病原同时检测不影响环介导PCR检测特异性和灵敏性。利用该方法对117份临床样本进行检测,结果显示,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4阳性检出率分别为15.4%,27.4%和34.2%,分别高于常规PCR 12.8%,23.9%和32.5%,接近于SybrGreen实时PCR 15.4%,28.2%和35%;kappa一致性检验显示,环介导PCR、SybrGreen实时PCR两种方法对AIV、NDV和FAV-4检测结果高度符合,Kappa值分别为κ=0.93、κ=0.89和κ=0.94。本研究成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR检测方法,适用于临床上3种病原的快速鉴别诊断。