3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液；基于分光光度法原理，优化检测反应体系，利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库，表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成，温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法，重复性变异系数在3%以下。