| LbCpf1基因的原核表达、纯化与体外切割检测 * |
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| 引用本文： | 吕一凡,李更东,薛楠,吕国梁,时邵辉,王春生. LbCpf1基因的原核表达、纯化与体外切割检测 *[J]. 中国生物工程杂志, 1981, 40(8): 41-48. DOI: 10.13523/j.cb.2003057 |
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| 作者姓名： | 吕一凡 李更东 薛楠 吕国梁 时邵辉 王春生 |
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| 作者单位： | 东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040 |
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| 基金项目： | * 黑龙江省大学生创新创业训练计划(201910225232);黑龙江省自然科学基金(C2016012) |
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| 摘 要： | 目的:为获得具有体外切割活性的LbCpf1蛋白。方法: 将毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCpf1基因编码区连接至pHis*6(IV),构建原核表达质粒CRISPR-LbCpf1-6*His。将该重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化、透析除盐和凝胶电泳检测等步骤获得重组蛋白,进行体外切割试验鉴定重组蛋白切割活性。结果: 双酶切鉴定和测序结果表明成功构建重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His,经转化后获得含有重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His的BL21(DE3)蛋白表达菌株。将菌株接种于37 ℃,160 r/min,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导5 h,最终镍柱纯化除盐后的LbCpf1蛋白终浓度可达400 ng/μl,在体外适宜条件下,该重组蛋白可与成熟的crRNA结合切断标靶DNA。结论: 获得的高纯度LbCpf1蛋白具有体外切割活性,可用于后续基因编辑研究。
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| 关 键 词： | LbCpf1蛋白 原核表达 镍柱纯化 体外切割检测 |
| 收稿时间： | 2020-03-23 |
Prokaryotic Expression,Purification of LbCpf1 Protein Gene and in Vitro Cleavage Activity Assay |
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| LV Yi-fan,LI Geng-dong,XUE Nan,LV Guo-liang,SHI Shao-hui,WANG Chun-sheng. Prokaryotic Expression,Purification of LbCpf1 Protein Gene and in Vitro Cleavage Activity Assay[J]. China Biotechnology, 1981, 40(8): 41-48. DOI: 10.13523/j.cb.2003057 |
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| Authors: | LV Yi-fan LI Geng-dong XUE Nan LV Guo-liang SHI Shao-hui WANG Chun-sheng |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | LbCpf1 Prokaryotic expression Nickel column purification In vitro cleavage activity assay |
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