双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因 |
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引用本文: | 朱甫祥,杨树德,刘泽隆,缪静,屈慧鸽,迟晓艳.双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因[J].中国细胞生物学学报,2012(1):23-29. |
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作者姓名: | 朱甫祥 杨树德 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 |
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作者单位: | 鲁东大学生命科学学院 |
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基金项目: | 山东省自然科学基金(No.ZR2010CM061);烟台市科技计划项目(No.2008152);教育部留学回国人员科研启动基金(No.20071108)资助项目~~ |
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摘 要: | 用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。
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关 键 词: | 凝血Ⅷ因子 双载体 链间二硫键 重链分泌 |
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