| 乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定北大核心 |
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| 引用本文： | 邸洋,王茂鹏,李昌,潘荣荣,荣凤君,杜寿文,朱羿龙,郭焱,金宁一.乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定北大核心[J].生物技术,2017(1):9-16. |
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| 作者姓名： | 邸洋 王茂鹏 李昌 潘荣荣 荣凤君 杜寿文 朱羿龙 郭焱 金宁一 |
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| 作者单位： | 1.长春中医药大学药学院130117;2.军事医学科学院军事兽医研究所130122;3.长春中医药大学基础医学院130117;4.温州大学病毒病研究所325035;5.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心225009; |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目(“IFITMs限制病毒进入的分子机制及其免疫调控研究”；No.31472197)；病原微生物生物安全国家重点实验室开放课题(“宿主限制因子IFITM3抗SFTSV作用及其机制研究”；No.SKLPBS1435)；北京市自然科学基金项目(“干扰素诱导跨膜蛋白抵御病毒感染的分子机制研究”；No.5152023) |
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| 摘 要： | 目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆。通过转化,构建重组质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX。应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测。结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480log X+45.34,扩增效率为93.8%;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327log X+37.07,扩增效率为99.8%。结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法。
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| 关 键 词： | 乳酸菌 基因编辑 重组表达质粒 gRNA CRISPR |
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