Wnt通路中蓬松蛋白DNA甲基化对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化影响

摘要 目的：探讨蓬松蛋白（DVL）DNA甲基化对骨质疏松（OP）患者骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化及Wnt通路的影响。方法：分离、培养OP患者的BMSCs，成骨诱导培养BMSCs 0、7、14、21天，观察BMSCs细胞形态变化，检测碱性磷酸酶（ALP）染色及活性，检测茜素红染色及钙结节形成，荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）及免疫印迹检测远端缺失同源盒5（Dlx5）、核心结合蛋白因子2（Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（OSX）、Ⅰ型胶原蛋白（Colla Ⅰ）表达。检测DVL1、Wnt、糖原合成酶激酶3（GSK3）、β连环蛋白（β-catenin）表达及DVL DNA甲基化水平。在成骨诱导培养基中加入甲基转移酶抑制剂5-Aza，将BMSCs分为对照组（Control组）、甲基转移酶抑制剂组（5-Aza组）、甲基转移酶抑制剂+si-NC组（5-Aza+si-NC组）、甲基转移酶抑制剂+si-Wnt组（5-Aza+si-Wnt组），依次进行ALP活性测定，茜素红染色及钙结节形成测定。RT-PCR检测Dlx5、Runx2、OSX、Colla 1水平，免疫印迹检测Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ、DVL1、Wnt、GSK3、β-catenin的蛋白表达量，并检测DVL DNA甲基化水平。结果：成骨诱导后BMSCs具有强的ALP活性和矿化结节生成能力，且随着培养时间的增长，BMSCs细胞ALP活性和矿化结节生成能力增强，Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA水平和Wnt、GSK3、β-catenin、DVL1表达升高，DVL DNA甲基化水平降低（P＜0.05）。5-Aza组较Control组ALP染色加深，活性增强，钙结节形成增多（P＜0.05），Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA及蛋白表达、Wnt、GSK3、β-catenin、DVL1表达升高，DVL DNA甲基化水平降低（P＜0.05）。5-Aza+si-Wnt组较5-Aza+si-NC组ALP染色变浅，活性降低，钙结节形成减少（P＜0.05），Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA及蛋白表达、Wnt、GSK3、β-catenin、DVL1表达降低，DVL DNA甲基化水平升高（P＜0.05）。结论：DVL DNA甲基化可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制OP患者BMSCs成骨分化。

Effects of Dishevelled Protein DNA Methylation in Wnt Pathway on Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Osteoporosis Patients