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| GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探 | |
| 作者姓名： | 李霞 李晓红 周涯 马峰 张勇刚 |
| 作者单位： | 中国医学科学院北京协和医学院输血研究所 |
| 摘 要： | 本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34+、CD43+及CD45+细胞增多,但GPA+、CD41a+及CD42b+细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不... |
| 关 键 词： | GATA1 GATA1s 多能干细胞 基因敲入技术 聚簇规则间隔短回文重复序列 CRISPR相关蛋白 造血分化 |