全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC．用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因．将ScFv基因与载体fuse5连接后，电击转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选．筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序．结果表明，经EBV转化的4例肝癌患者PBMC，ELISA检测均有抗肝癌抗体产生，经多次PCR，扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因，经连接组成54种ScFv基因．将ScFv基因与载体连接后，导入大肠杆菌MC1061，得到库容为1．0×10^8的初级噬菌体抗体库，全长ScFv基因的插入率为80％．用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选，得到179个阳性克隆，阳性率为33．6％．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定，发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应，免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应，而不与正常肝组织反应．且A82的相对亲和力为2．4mol／L，解离常数Kd为5．32×10^-9mol／L，显示其亲和力较高．对克隆A82进行测序分析，结果表明：A82全长742bp，含linker cDNA序列45bp，重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3％的同源性，轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94．9％的同源性，V．D．J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2．由上述结果可见，应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建了库容量达1×10^8的全人源抗肝癌单链抗体库，通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．

Construction and Screening of Human Anti-hepatoma Single-chain Fv Fusion Phage Libraries