| 摘 要： | 【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD~+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, k_(cat)值为2.4±0.06/s~(–1),5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg~(2+)和Mn~(2+)可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。
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