蒺藜苜蓿MtbHLH25基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】bHLH转录因子数量众多，能够广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程。本试验以蒺藜苜蓿R108为材料，初步探讨MtbHLH25基因的功能。【方法】通过PCR扩增技术从蒺藜苜蓿中克隆MtbHLH25基因和启动子，构建酵母表达载体并用LiAc转化法转移到Y2H Gold酵母菌株中进行酵母自激活检测，构建亚细胞定位载体并通过冻融法转入农杆菌EHA105，菌液注射到烟草下表皮细胞后利用SP8激光共聚焦显微镜观察，通过实时荧光定量PCR技术研究MtbHLH25基因的时空表达水平。【结果】（1）从蒺藜苜蓿中成功克隆出MtbHLH25基因和启动子，该基因总长882 bp，共编码293个氨基酸。启动子序列分析发现其包含了ABA、MeJA、GA和SA等响应元件。（2）进化树结果表明MtbHLH25蛋白与蚕豆和长柔毛野豌豆中bHLH蛋白高度同源。（3）亚细胞定位结果显示MtbHLH25蛋白定位于细胞核。（4）酵母自激活检测结果显示MtbHLH25蛋白具有自激活活性。（5）表达分析结果显示，MtbHLH25在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花和果实中均有表达，其中在根中表达水平最高；外源SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫使MtbHLH25基因表达量都呈下降趋势，推测SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫对MtbHLH25基因的表达起到负调控作用。干旱胁迫能够显著诱导MtbHLH25基因表达量的上升，说明该转录因子可能在干旱胁迫中起到正调控作用。【结论】MtbHLH25基因可能对盐胁迫敏感，在干旱胁迫中可能发挥正调控作用。此外，MtbHLH25蛋白具有自激活活性，对下游启动子调控的报告基因可能具有激活作用。

Gene cloning, Subcellular Localization and Expression Analysis of MtbHLH25 Gene in Medicago truncatula