胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究

由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此，研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。目的] 以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象，以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标，比较胞嘧啶单碱基编辑技术（CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor，CBE）和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异，为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时，也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。方法] 采用PCR、Golden Gate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证，采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率，采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外，本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。结果] 经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明，本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中，应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。结论] CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显，但同λ-Red系统相比，该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点，在非模式菌株中的普适性较低，且在进行编辑时，CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此，但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立，为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。