用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

小鼠pαMHC-EGFP胚胎干细胞株的构建

应用电穿孔方法将含有α肌球蛋白重链启动子的pαMHC-EGFP载体转染到D3系小鼠胚胎千细胞,应用200μg／ml新霉素进行药物选择。采用悬浮培养法,体外诱导分化心肌细胞。荧光显微镜下,观察到第7天和第8天拟胚体中出现“跳动”的心肌细胞并同时有绿色荧光蛋白的表达。同时与D3系小鼠胚胎干细胞比较心肌细胞分化率的变化无显著差异（P〉0．05）。该细胞株在分化心肌细胞的同时,具有绿色荧光蛋白的标记,因而利于对心肌细胞的识别和纯化。     

基于纳米基因载体的动植物遗传转化研究进展

转基因技术在动植物优良新品种的培育中发挥着重要作用,而随着纳米生物技术的发展,基于纳米材料构建基因载体的动植物转基因技术,对于发展动植物转基因新方法以及加速转基因种质材料的大规模制备、优良新品种的培育进程具有更为重要的意义。综述了纳米基因载体的种类与性质,并结合动植物遗传育种的研究进展,分析了纳米基因载体相比于其他载体的特点及优势,同时,重点阐述了基于纳米基因载体的基因转染技术的基本原理和操作过程,及其在动植物遗传转化中的应用,以期为动植物基因工程改造提供新思路。     

珍珠黄杨矮化基因BsGAI2的克隆及功能分析

GA信号转导途径或生物合成受阻是导致植物矮化的重要因素,而DELLA蛋白是GA信号传导通路中一类重要的负调节因子。本研究利用同源克隆和RACE技术,从珍珠黄杨中克隆得到BsGAI2基因的c DNA序列,全长为2305 bp,包括1836 bp完整的ORF。实时荧光定量表达分析表明,BsGAI2基因在珍珠黄杨茎中表达量最高,在根中表达量最低;BsGAI2转基因烟草呈明显矮化,节间变短,长势较慢,延迟开花等特征。利用GFP荧光检测方法鉴定转化型烟草,发现转化苗的叶、茎中均有荧光信号,并且茎木质部有明亮富集的荧光信号。这些结果均表明BsGAI2基因可能在珍珠黄杨茎节间缩短导致矮化的过程中扮演重要角色。本研究分析了BsGAI2基因编码蛋白的理化性质和功能鉴定,为今后进一步研究BsGAI2基因及DELLA蛋白家族的功能提供了理论依据。     

基因转移技术在观赏植物抗性育种中的应用

各种病虫害、杂草、逆境胁迫等不仅会大大降低观赏植物品质,同时也限制了不同类型观赏植物在世界范围内的分布和应用。综述了抗虫、抗病、抗除草剂、抗寒、抗冻、抗旱等抗性基因在观赏植物抗性育种的应用,提出了当前观赏植物转基因抗性育种中存在的问题并展望了今后的工作重点。     

海岛棉GbHCT13基因的功能验证

该研究利用海岛棉‘新海21’和陆地棉ND203以及模式植物拟南芥,通过转基因及荧光定量检测等方法探究海岛棉GbHCT13基因(GenBank 登录号MW048849)在纤维发育中的功能。结果显示：(1)成功构建重组载体pCAMBIA3301 GbHCT13,经农杆菌介导法转化、除草剂抗性基因筛选、荧光定量检测方法鉴定获得转GbHCT13基因拟南芥T₃代植株4株;qRT PCR检测表明,转基因植株中GbHCT13基因表达量较野生型极显著增加。(2)转基因拟南芥过表达GbHCT13基因使植株同一时期的生长较野生型旺盛,株形、叶片数、抽薹数和茎秆表皮毛数量均与野生型存在差异;组织化学分析发现,转GbHCT13基因的拟南芥较野生型茎秆初生木质部生长活跃,导管增粗,次生木质部导管细胞壁横截面积变大,但髓质细胞无明显变化;过表达GbHCT13使拟南芥中木质素合成途径基因发生不同程度改变,其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL与GbHCT13基因的表达呈正相关。(3)经大田筛选、分子鉴定,成功获得转GbHCT13基因棉花植株3株;转GbHCT13基因棉花的棉纤维伸长率增加,纤维强度增大;沉默GbHCT13基因使棉花植株木质素含量降低,茎秆表皮毛数量减少,木质部导管细胞数量减少,导管细胞壁中木质素沉积量降低,而棉株并未发生株高上的明显矮化现象,且木质素合成通路中的CAD、CCoAOMT、CCR、PAL 4个基因的表达均呈降低趋势,说明抑制GbHCT13使得棉花生长代谢受阻,影响纤维发育起始。研究表明,GbHCT13基因能影响棉花植株中木质素合成从而调控纤维的生长发育,其功能与GbHCT13基因在模式植物拟南芥中的基本一致。     

兔Oct4启动子驱动RFP基因表达载体的构建及验证

转录因子OCT4在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。Oct4基因启动子驱动标志蛋白的表达对研究胚胎干细胞多能性和建立iPs细胞有重要意义。由于GFP在慢病毒转染过程中常用作转染标记,计划构建兔Oct4基因启动子（rOct4）驱动红色荧光蛋白表达的载体,这将有利于兔ES细胞和iPS细胞制备的研究。通过PCR方法扩增rOct4,构建了rOct4驱动RFP基因的表达载体rOct4-RFP。经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOct4-RFP质粒转染兔成纤维细胞系获得rOct4-RFP成纤维细胞系。经过酶切和测序验证,证明rOct4-RFP构建成功,而且能够在小鼠Es细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,并受细胞分化状态的调控。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOct4-RFP转基因成纤维细胞系。     

陆地棉GhCDPK1基因响应干旱胁迫的功能初探

钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答中起着重要的调控作用。为探讨陆地棉GhCDPK1基因在干旱胁迫下所起的作用,该研究利用实时荧光定量PCR技术分析了PEG模拟干旱胁迫下该基因的表达量,发现GhCDPK1基因受干旱胁迫诱导。通过构建植物表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK1,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,发现干旱胁迫下转基因植株保水能力明显高于野生型植株,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究结果表明,GhCDPK1基因作为正向调控因子响应干旱胁迫诱导,过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。     

碳离子束辐照拟南芥介导外源基因转移的研究

采用700keV或4.0MeV碳离子束辐照拟南芥种子,通过对样品的显微摄影,发现随着辐照剂量的增加,碳离子束对种子表面的损伤逐渐加剧,特别是在4.0MeV碳离子束辐照下,当剂量达到1×1014ions·cm-2后,种皮局部逐渐被刻蚀殆尽,甚至造成种皮局部破裂。对拟南芥种子进行台盼蓝染色后的显微观测显示,碳离子束辐照可以导致拟南芥种皮细胞着染,在剂量较大的情况下,部分皮下细胞也可着染,表明碳离子束可作用到皮下细胞,为外源基因提供导入的通道。GUS基因导入后的组织化学检测表明:质粒pCAMBIA1301能够进入4.0MeV碳离子束辐照后的拟南芥种子,并在种子和幼芽中获得瞬间表达。     

基因芯片技术筛选转SlNAC1基因拟南芥差异表达基因

研究已表明植物特有的一些NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子可提高植物抗逆性,利用基因芯片技术筛选转SlNAC1基因拟南芥与野生型拟南芥间差异表达基因,能够为研究转基因拟南芥非生物胁迫抗性相关基因提供依据。结果显示,在转SlNAC1基因拟南芥43 604个基因中有3 046个差异表达2倍以上的基因。对差异表达5倍以上基因经过GO富集度统计学分析表明,细胞组分相关基因占33.05%;分子功能相关基因占33.95%;生物学过程相关基因占33.00%。对差异表达2倍以上基因进行KEGG信号通路分析,结果表明有2 431个基因涉及到88个不同的信号通路。通过筛选获得转基因拟南芥非生物胁迫抗性相关候选基因,为后续研究NAC转录因子的下游基因及其调控网络的构建提供方向和理论支撑。