珠江口城市段近岸表层水体浮游细菌分离方法比较

为了更好地分离珠江口未/难培养的浮游细菌,本研究以珠江河口三个样点的水体为研究对象,同时采用了纯培养和免培养的方法,对不同培养基的分离效果进行了探索。在纯培养实验中,本研究选择了7种不同的分离培养基,共分离获得153株菌;同时,将扩增子分析结果作为分离效果的参考,所有环境样品中共包含3 553个操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs）。对三个样点微生物类群的多样性进行比较,纯培养结果显示珠江口下游珠海样点多样性最高,其次为中大和虎门样点;免培养则显示虎门样点多样性最高;对比7种不同的分离培养基,Z7（R₂A）培养基的分离效果最好,分离菌株数和分离类群的α多样性最高,Z1（改良ISP 2）次之;主坐标分析结合韦恩图的结果表明相比其余的培养基,Z1和Z7培养基分离获得的菌群兼具普遍性和特异性,进一步证明了这两种培养基的分离效果较佳;冗余分析结果表明K₂HPO₄、酵母粉、可溶性淀粉、MgSO₄·7H₂O、麦芽膏和葡萄糖与特定类群的分离有相关关系,其中K₂HPO₄的影响最为显著（P<0.05）。本文通过7种不同培养基对河口微生物分离效果的探究,有助于我们在研究未知微生物的营养特性时,选择成分和组成更合理的培养基来提升河口微生物纯培养的分离效率。     

小溪自然保护区非盐环境土壤中嗜盐和耐盐菌多样性

【目的】研究湖南小溪国家级自然保护区普通非盐环境(ordinary non-saline environment)土壤样品中可培养嗜盐及耐盐细菌(含放线菌)多样性。【方法】采用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对样品中嗜盐及耐盐细菌多样性进行研究。【结果】用补充5%-20%(w/v)NaCl的MA、ISP2、ISP5、NA和HAA培养基从土壤样品中分离到114株细菌,其中8株为中度嗜盐菌,19株为轻度嗜盐菌,87株为耐盐菌。根据形态观察和部分生理生化实验结果去冗余,选取61个代表性菌株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明,这些菌株属于细菌域(Bacteria)的3个大的系统发育类群(门;phylum)(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)的16个科、18个属,代表了41个物种。多数菌株属于Firmicutes门(38株,62.3%)和Actinobacteria门(18株,29.5%)。大多数菌株与其系统发育关系最密切的已知物种的典型菌株之间存在一定的遗传差异(16S rRNA基因序列相似性为96.9%-99.8%),其中有7个菌株(JSM070026,JSM081004,JSM081006,JSM081008,JSM083058,JSM083085,JSM084035)代表7个潜在新种(potential novel species)。【结论】研究结果表明,湖南小溪国家级自然保护区普通非盐环境土壤中存在较为丰富的可培养嗜盐及耐盐细菌多样性,并且潜藏着较多新的微生物类群(物种)。     

土壤微生物群落多样性解析法:从培养到非培养

土壤微生物群落多样性是土壤微生物生态学和环境科学的重点研究内容之一.传统的土壤微生物群落多样性解析技术是指纯培养分离法(平板分离和形态分析法以及群落水平生理学指纹法).后来,研究者们建立了多样性评价较为客观的生物标记法(磷脂脂肪酸法和呼吸醌指纹法).随着土壤基因组提取技术和基因片段扩增(PCR)技术的发展,大量的现代分子生物学技术不断地涌现并极大地推动了土壤微生物群落多样性的研究进程.这些技术主要包括:G+C％含量、DNA复性动力学、核酸杂交法(FISH和DNA芯片技术)、土壤宏基因组学以及DNA指纹图谱技术等.综述了这些技术的基本原理、比较了各种技术的优缺点并且介绍了他们在土壤微生物群落多样性研究中的应用,展望了这些技术的发展方向.     

新疆罗布泊地区可培养嗜盐古菌多样性及其功能酶筛选

【目的】探索新疆罗布泊地区高盐环境可培养嗜盐古菌的多样性及其功能酶应用潜力。【方法】采集罗布泊地区13份土样,用纯培养并结合基于16S rRNA基因系统发育分析的方法来研究样品中嗜盐古菌的多样性。按系统进化树的聚类关系,挑选出一些菌株进行盐度耐受及淀粉酶、蛋白酶、酯酶的酶活检测。【结果】从13份土样中共分离到56株嗜盐古菌,经16S rRNA基因克隆测序,通过MEGA 4.0构建N-J树分析,56株菌分布于嗜盐古菌的10个生效发表属和5个潜在新属。运用Shannon-Wiener方法计算其多样性指数为1.820。挑选17株嗜盐古菌所测试盐浓度实验结果表明这一批嗜盐古菌的大部分生长范围在10%-35%之间,最适盐浓度在20%-25%之间。不同酶活检测结果为:淀粉酶酶活率为70.6%,蛋白酶酶活率为35.3%,酯酶酶活率为82.4%。【结论】新疆罗布泊周边地区由于气候及地理位置的独特性,蕴藏丰富的嗜盐古菌资源。本实验所设计的分离方法对嗜盐古菌的分离是极其有效的,为进一步研究新疆罗布泊及周边地区嗜盐古菌资源提供了技术基础。盐度耐受实验结果验证在低盐环境中分离嗜盐古菌新物种的可行性。同时,嗜盐古菌的酶活比率较高且活性较强为进一步开发利用嗜盐古菌资源提供了理论依据。     

南药植物高良姜内生细菌多样性及其促生潜力

以道地产地高良姜为材料,对该药用植物内生细菌种群组成、组织分布及其促生潜力进行了研究。采用组织块分离法,从高良姜根、根茎、茎和叶4个组织共计分离得到细菌136株,分属于16个16S r DNA基因型、12个细菌属、15个细菌种,其中,芽孢杆菌、甲基杆菌分别为其最、次优势种群。各种群分离比随组织不同而异;采用Hha I消化的末端限制性片段多态性(TRFLP)免培养方法,从高良姜4个组织共计检测到36个不同的末端限制性酶切片段(T-RFs)。种群对应分析表明其免培养内生细菌群体主要包括芽孢杆菌、甲基杆菌等高抗性细菌,海洋螺菌、红杆菌、交替假单胞菌等海洋细菌及热带根瘤菌、沼泽考克氏菌等热带相关细菌,说明高良姜内生细菌群体与其宿主植物生长环境密切相关。不同组织其总T-RFs数目、优势T-RFs及其对应细菌种群明显不同;在所分离的细菌菌株中,36.36%、51.52%、54.55%和27.27%的菌株分别显示了胞外几丁质酶、β-葡聚糖酶,生长素及其1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶产生能力。其中,泛菌L-2、芽孢杆菌S-16所测4个指标均为阳性,热带根瘤菌菌株R-1和R-3显示了较高的ACC脱氨酶及生长素产生能力,这些菌株是促生菌剂的良好候选。     

环贵州喀斯特高原湖泊环境中的细菌多样性

采用纯培养方法,选用6种培养基对23份环贵州喀斯特高原湖泊环境土壤样品中的细菌进行分离培养,经初步形态排重后共获得83株细菌纯培养物。菌株的16S rRNA基因序列信息显示,这些菌株归属于3门12目15科19属,优势细菌类群为链霉菌属（Streptomyces）、芽胞杆菌属（Bacillus）、短芽胞杆菌属(Brevibacillus）和北里孢菌属（Kitasatospora）。同时采用高通量测序分析的方法评估了这些土壤样品中的细菌群落结构特征。环境样品中16S rRNA基因的V3~V4区序列分析显示,从土壤样品中检测到分属于17门36目74科130属的细菌,涵盖喀斯特高矿物质环境、盐碱湖泊环境、森林土壤环境中存在的优势菌群,其中变杆菌属(Variibacter)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)以及嗜酸栖热菌属（Acidothermus）为优势属,体现出该生境中细菌群落结构的独特性。综合纯培养和高通量测序分析结果,环贵州喀斯特高原湖泊环境样品中细菌群落特征和环境之间存在着明显相关性,其中蕴含着丰富的细菌资源,值得进一步挖掘。     

浙江苍南近海沉积物细菌物种多样性

针对浙江苍南大渔湾近海海底沉积物样品（东经120&#176;34′28．6″,北纬27&#176;19′57．3″）,采用非培养法构建分子文库,并结合纯培养法分离培养海洋微生物,基于克隆子和分离菌株的16SrRNA基因序列,开展系统发育学研究,分析近海沉积物细菌群落结构及多样性。序列分析结果表明,文库克隆子主要属于δ-变形杆菌纲（Deltaproteobacteria）和γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）,部分序列与已报道物种的相似性较低,表明浙江苍南近海环境样品具有较好的微生物多样性,蕴藏着大量未知细菌物种资源。研究还分离获得细菌79株,丰富了近海微牛物资源库。分子鉴定结果表明,这些菌株主要属于α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）和芽孢杆菌纲（Bacilli）。通过非培养和可培养数据结合发现,浙江苍南近海沉积物中的细菌优势类群为δ-变形杆菌和γ-变形杆菌。     

The biogeography of fungal communities in wetland sediments along the Changjiang River and other sites in China

Whether fungal community structure depends more on historical factors or on contemporary factors is controversial. This study used culture-dependent and -independent (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)) methods to assess the influence of historical and contemporary factors on the distributions of fungi in the wetland sediments at 10 locations along the Changjiang River and at 10 other locations in China. The culture-dependent approach detected greater species diversity (177 operational taxonomic units (OTUs)) than PCR-DGGE analysis (145 OTUs), and the species in the genera of Penicillium (relative frequency=16.8%), Fusarium (15.4%), Aspergillus (7.6%), Trichoderma (5.8%) and Talaromyces (4.2%) were dominant. On the basis of DGGE data, fungal diversity along the Changjiang River increased from upstream to downstream; altitude explained 44.8% of this variation in diversity. And based on the data from all 20 locations, the fungal communities were geographically clustered into three groups: Southern China, Northern China and the Qinghai-Tibetan Plateau. Multivariate regression tree analysis for data from the 20 locations indicated that the fungal community was influenced primarily by location (which explained 61.8% of the variation at a large scale), followed by total potassium (9.4%) and total nitrogen (3.5%) at a local scale. These results are consistent with the concept that geographic distance is the dominant factor driving variation in fungal diversity at a regional scale (1000–4000 km), whereas environmental factors (total potassium and total nitrogen) explain variation in fungal diversity at a local scale (<1000 km).     

矿区复合污染土壤真菌多样性及其对稀土-重金属离子的吸附特征

大量的稀土-重金属通过尾矿坝的浮尘、地表径流和渗滤液排放到周边土壤中,影响了土壤中的微生物群落结构。【目的】分析稀土和重金属复合污染土壤真菌群落结构并分离具有同时吸附稀土和重金属的菌株。【方法】本研究基于ITS基因,采用Illumina-Hiseq测序技术分析了包头稀土尾矿坝周边5份稀土-重金属污染土壤样品和距尾矿区20 km的1份相对未受污染的土壤样品的真菌群落特征,同时采用富集培养法从污染样品中筛选出金属耐性真菌,并对其进行吸附稀土-重金属的特性分析。【结果】群落结构为:在门水平,除了未分类门真菌(unclassified Fungi)外,子囊菌门(Ascomycota)真菌在所有土壤中占比较大(13.5%–90.5%);在纲水平上,除了未分类纲真菌外,粪壳菌纲(Sordariomycetes)真菌在B2 (73.1%)、B3 (28.4%)和B4 (20.8%)的丰度显著高于对照样点C (7.4%),而座囊菌纲(Dothideomycetes)在B5 (11.8%)的丰度明显高于B1 (3.5%);在属水平,除了未分类属,足孢子虫属(Podospora)是C(0.9%)和B3(23.6%)样点的优势种。曲霉属(Aspergillus)、未分类的格孢腔菌目(unclassified Pleosporales)和未分类的戴维迪科(unclassified Davidiellaceae)分别为B1 (3.0%)、B4 (10.5%)和B5(5.8%)的优势种,而蜡蚧属(Lecanicillium)真菌只在B2样点土壤存在且占优(51.6%)。Zn污染对真菌群落结构的影响大于稀土元素污染,且其浓度与优势的未分类真菌相对丰度呈负相关。从污染样品中共分离出6株真菌,它们分属于曲霉属(Aspergillus)(5株)和镰刀霉菌属(Fusarium)(1株)。所有分离菌株对镧(La~(3+))的吸附率均显著高于锌(Zn~(2+)),其中Aspergillus sp. B6-3对La~(3+)和锌Zn~(2+)的吸附率最高,分别为19.7%和3.9%。【结论】该研究为利用真菌去除稀土和重金属以优化生物吸附过程导向的环境生物修复和保护策略提供了机制基础。     

Characterization of the microbial diversity in a permafrost sample from the Canadian high Arctic using culture-dependent and culture-independent methods

A combination of culture-dependent and culture-independent methodologies (Bacteria and Archaea 16S rRNA gene clone library analyses) was used to determine the microbial diversity present within a geographically distinct high Arctic permafrost sample. Culturable Bacteria isolates, identified by 16S rRNA gene sequencing, belonged to the phyla Firmicutes, Actinobacteria and Proteobacteria with spore-forming Firmicutes being the most abundant; the majority of the isolates (19/23) were psychrotolerant, some (11/23) were halotolerant, and three isolates grew at -5 degrees C. A Bacteria 16S rRNA gene library containing 101 clones was composed of 42 phylotypes related to diverse phylogenetic groups including the Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Cytophaga - Flavobacteria - Bacteroides, Planctomyces and Gemmatimonadetes; the bacterial 16S rRNA gene phylotypes were dominated by Actinobacteria- and Proteobacteria-related sequences. An Archaea 16S rRNA gene clone library containing 56 clones was made up of 11 phylotypes and contained sequences related to both of the major Archaea domains (Euryarchaeota and Crenarchaeota); the majority of sequences in the Archaea library were related to halophilic Archaea. Characterization of the microbial diversity existing within permafrost environments is important as it will lead to a better understanding of how microorganisms function and survive in such extreme cryoenvironments.