新城疫病毒7793 HN蛋白在昆虫SF9细胞中的表达研究

本实验对新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV) 7793 HN蛋白在杆状病毒表达系统中表达进行研究。提取病毒RNA并将其逆转录成cDNA,经PCR同义点突变在HN基因片段中加入NcoⅠ/XhoⅠ酶切位点,通过该酶切位点将HN基因克隆至穿梭载体p FastBac1质粒以构建重组质粒pFastBac1HTB-HN,然后用脂质体转染pFastBac1HTB-HN杆粒至昆虫SF9细胞。28℃无菌培养含pFastBac1HTB-HN杆粒的SF9细胞48 h,收集细胞培养上清液中的第一代病毒,感染SF9细胞,置28℃无菌培养60 h,收集细胞培养上清液,离心去除细胞碎片,取上清液中的第二代病毒,继续感染SF9细胞,置28℃无菌培养72 h,收集SF9细胞,用SDSPAGE和Western blotting验证HN蛋白的表达。SDS-PAGE和Western blotting均显示HN杆粒感染的SF9细胞成功表达了HN蛋白。本研究结果为进一步研究NDV7793-HN蛋白的抗肿瘤作用提供可靠试验依据。     

表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

在克隆和鉴定新城疫病毒（NDV）F48E8株血凝素－神经氨酸酶（HN）基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175－1中启动子P7．5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175－1。将此质粒pFGHN1175－1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3～4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV—HN基因特异性探针进行斑点杂交试验以及用HN基因特异性引物作PCR检测,表明NDV—HN基因已插入鸡痘病毒基因组中。以NDV－HN蛋白特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,证实重组鸡痘病毒在感染细胞中表达了HN糖蛋白,从而成功建立了表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒。