湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行诱导表达和纯化,研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸,包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域;重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa,最适反应温度和pH分别为40℃和6.0,在30-50℃下活性较高,在pH 4.0-8.0范围内能够保持较高的稳定性,经pH 4.0-8.0缓冲液处理1 h后残余活性均大于90%;底物谱分析表明,rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖,比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73) U/mg;利用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物发现,rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%),催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25 (EC 3.2.1.4),能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖,为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。     

生物炭-牛粪堆肥中产β-葡聚糖苷酶微生物群落应答碳代谢抑制效应

【背景】在高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应下,产β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)功能微生物群落为适应碳代谢压力的变化,会差异化表达糖耐受和非糖耐受的功能基因。在堆肥中添加生物炭可以改变微生物生存的环境,进而影响微生物群落的组成与功能。【目的】分析在不同碳代谢压力下添加生物炭对产β-葡聚糖苷酶功能微生物群落的结构组成与功能的影响。【方法】在生物炭牛粪-稻草堆肥中添加葡萄糖、纤维二糖及β-葡聚糖苷酶抑制剂,构建不同的碳代谢压力。以细菌来源GH1家族的β-葡聚糖苷酶基因为分子标记基因构建基因克隆文库。同时测定羧甲基纤维素酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶活。【结果】放线菌、变形菌和拟杆菌是功能微生物群落中的优势菌群。其中,CL处理组变形菌数量有所下降,在添加了抑制剂的处理组中,拟杆菌的数量明显上升。高浓度葡萄糖显著抑制了羧甲基纤维素酶酶活,但对β-葡聚糖苷酶酶活影响不大,其中低浓度纤维二糖的处理可以显著诱导β-葡聚糖苷酶活性。GHCH处理组中β-葡聚糖苷酶表现出高浓度葡萄糖激活特性。【结论】添加生物炭未明显影响参与纤维素降解的功能微生物群落对碳代谢抑制效应的应答。与自然堆肥相比,在添加了生...     

饲料中灵芝提取物对异育银鲫生长、饲料利用、免疫应答及抗病的影响

通过生长实验探求饲料中添加灵芝提取物饲料对异育银鲫（6.720.11） g生长、饲料利用及免疫应答的影响,以及停止灵芝提取物饲料后,使用效果的持续性。在实验进行的第21天（D21）、第46天（D46）、第65天（D65）进行取样,结果表明所有的灵芝提取物组的特定生长率在饲喂65d后与对照组无显著差异（P0.05）。摄食率随着灵芝提取物在饲料中含量的增加而增加（P0.05）,饲料效率则有着相反的趋势（P0.05）。在D46和D65时,随着灵芝提取物的含量增高,吞噬活力略有增高,但无显著差异（P0.05）。在D21、D46和D65时,呼吸暴发活力随着灵芝提取物的含量增高而增高（P0.05）,在D21时,（0.6%-21d、0%-44d）处理组和（3%-21d、0%-44d）处理组其呼吸暴发活力高于对照组（P0.05）。在D65时,（0.6%-21d、0%-44d）处理组和（3%-21d、0%-44d）处理组其呼吸暴发活力仍高于对照组（P0.05）,但差异不显著。D21、D46和D65时,替代途径补体溶血活力随着灵芝提取物的增高而降低（P0.05）。所有处理组溶菌酶活力在D21时没有产生显著差异。在D46时,对照组溶菌酶活力比最高添加组低但高于低添加组（P0.05）,（3%-1d、0%-44d）处理组也仍高于对照组（P0.05）。在D65时,所有添加组的溶菌酶活力均低于对照组（P0.05）。在D65时,髓过氧化物酶活力随着灵芝提取物的添加剂量升高而升高（P0.05）,（0.6%-21d、0%-44d）处理组仍高于对照组（P0.05）。灵芝提取物的能提高白细胞呼吸暴发活力,且在在高剂量摄入21d后（D46时）,仍可以保持较高的活力,说明灵芝提取物对免疫应答有一定时间延续效应。随着灵芝提取物添加量的升高,异育银鲫在经爱德华氏菌攻毒后的存活率显著提高。最高存活率组为3%添加组,显著高于对照组（P0.05）。实验周期为65d时,饲料中灵芝提取物推荐添加剂量为3%。       

融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

BM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达.研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素(avicel)以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用.     

海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987菌株抑制病原真菌机理的研究

摘要：【目的】：探讨海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987菌株的代谢产物BMME-1,对植物病原真菌茄链格孢菌的抑菌作用机理。【方法】分别使用分光光法、气相色谱-质谱GC-MS联用技术、红外光谱法等,检测了BMME-1处理病原真菌后,菌体渗透性、细胞壁及细胞膜成份的变化。【结果】BMME-1对茄链格孢菌的抑菌中浓度（MIC50）为6.2 mg/L,最小杀菌浓度（MFC）为50 mg/L,在MIC50浓度或高于此浓度处理靶标菌,将导致菌体蛋白质、核酸等大分子物质的外流;处理菌株葡聚糖结     

脂环酸芽孢杆菌D-1的耐盐内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶学性质北大核心CSCD

【目的】克隆温泉中嗜热嗜酸的脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)的内切葡聚糖酶基因gluE1,并对该酶进行序列分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】通过全基因组测序获得gluE1全长,并对其氨基酸序列(GluE1)进行分析。将gluE1重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,利用组氨酸标签纯化GluE1并进行酶学性质分析。【结果】gluE1与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性,全长1020 bp,GC含量50.5%,编码339个氨基酸(40.45 k Da)。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97%,与其余纤维素酶的一致性<60%。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉和大麦β-葡聚糖,表观最适pH为6.5,pH 5.0–10.0稳定并维持60%以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃,在37℃下稳定。在55℃ pH 6.5条件下,GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_(max)和k_(cat)分别为8.58 mg/mL、416.67 U/mg和280.90 s^(–1)。GluE1受Ag^+、Hg^(2+)及SDS抑制,β-巯基乙醇、Pb^(2+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)和Na^+对GluE1有微弱的促进作用,NaCl对GluE1的影响不大,加入30%的NaCl,仍有64%以上的酶活性;经30%的NaCl在37℃下处理60 min,仍能保持93%以上的活性。【结论】首次报道从Alicyclobacillus属的细菌中克隆得到内切葡聚糖酶基因并对其酶学性质进行研究,GluE1具有良好的pH稳定性和有较强的耐盐性,可能具有更大应用潜力。     

茉莉酸甲酯对烟草幼苗抗病毒的影响

用茉莉酸甲酯处理4叶期烟草(Nicotiana tabacum L.)幼苗后接种烟草花叶病毒,考察发病情况和病情指数,并测定一些与抗病相关的酶活性。结果表明,茉莉酸甲酯处理后接种病毒明显降低巴两烟草的病情指数,提高几丁内切酶、β1,3-葡聚糖苷酶、SOD、脂氧酶的活件。其中仅SOD活性与抗病毒有较密切的关系。茉莉酸甲酯可能是诱导巴西烟草抗花叶病毒的信号物质。     

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

天麻球茎几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的初步研究

天麻(Gastrodia elata)是真菌寄生植物。密环菌侵入初生球茎并在其皮层被消化,营养物供次生球茎生长需要;密环菌不能侵染生长小的次生球茎。我们从初生球茎分离并纯化了几丁质酶和β—1,3—葡聚糖酶,分子量各为31.5 kD和94kD,得率各为0.8和0.4 mg/100 g鲜重。纯化几丁质酶的内切酶比活为208 nmol GlcNAc s~(-1)mg~(-1),外切酶比活为4.1 nmol GlcNAcs~(-1)mg~(-1);纯化葡聚糖酶比活为546 nmol Glc s~(-1)mg~(-1)。以相同鲜重计,初生球茎中二种酶的总活性各为次生球茎的34和56倍;这主要是由于次生球茎的酶比活性很低。二种酶对平板上培养的木霉菌丝的生长均有抑制作用,但抑菌活性均较天麻抗真菌蛋白(GAFP)低。我们认为这两种酶在天麻初生球茎消化密环菌菌丝的过程中起重要作用,而对天麻球茎阻止和限制密环菌侵染的抗菌作用贡献甚少,后者主要属于天麻抗真菌蛋白。