绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3在木霉生物防治作用中的功能分析

【目的】本文借助基因编辑技术在具有生物防治潜力的绿色木霉(Trichoderma viride)中敲除组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3,来研究TvRpd3基因及其编码蛋白在提高木霉病原菌拮抗能力中的作用。【方法】利用融合PCR和同源重组策略构建了TvRpd3基因缺失的突变菌株,通过对峙培养、表型观察、免疫组化检测、代谢组学分析等系统比较TvRpd3基因敲除前后菌株的组蛋白乙酰化修饰水平、次级代谢产物合成、病原菌拮抗能力以及田间防治效果等。【结果】与野生型菌株相比,缺失TvRpd3基因的木霉工程菌(?TvRpd3)对多种病原菌表现出了更强的对峙抑制效果,其所产的发酵液对小麦白粉病、烟草黑胫病和番茄枯萎病的防治效果分别提高了62.27%、57.45%和70.71%。同时,敲除TvRpd3基因也显著改变了木霉工程菌所产次级代谢产物的种类和产量,抗生性物质的产量大幅提高。【结论】绿色木霉TvRpd3基因及其介导的组蛋白乙酰化修饰在提高绿色木霉生物防治中起着重要作用。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

酶工程的现状与展望

生物工程是一门综合性技术,包括酶工程、发酵工程、细胞工程及基因工程。 生物工程与信息科学和材料科学构成了当今的三大前沿科学,随着生物工程在科研——开发——生产中的不断深入与发展,生物工程技术已从实验室进入了大规模生产人们所需要的工、农、医药等多种新产品的时期。生物工程产业已在世界范围内逢勃发展。美国、西欧与日本已成立了800多家生物工程公司,生物工程产品正在源源不断地进入市场。     

肠激酶在毕赤酵母中的分泌表达优化

肠激酶 (Enterokinase,EK) 是一类特异性识别切割DDDDK序列的丝氨酸蛋白酶,作为一种工具酶广泛应用于生物医药领域。目前,EK在毕赤酵母Pichia pastoris中的表达水平较低,难以应用。本研究比较了6种不同的信号肽SP1、SP2、SP3、SP4、SP7和SP8对毕赤酵母分泌表达EK的影响。在摇瓶水平上,与α-factor信号肽相比,SP1信号肽显著提高了EK的分泌表达 (从6.8 mg/L提高至14.3 mg/L),酶活从 (2 390±212) U/mL提高至 (4 995±378) U/mL。在此基础上,通过共表达毕赤酵母内源蛋白Kex2,EK酶活提高至 (7 219±489) U/mL。另外,N端融合WLR三个氨基酸进一步提高酶活至 (15 145±920) U/mL,比酶活为 (1 174 600±53 100) U/mg。EK在毕赤酵母中的高效分泌表达为未来应用奠定了基础。     

产溶剂梭菌分子遗传操作技术研究进展

产溶剂梭菌是一类重要的工业微生物.通过遗传改造以优化产溶剂梭菌的发酵性能一直是溶剂制造技术研究的重要课题,但长期受限于该类菌并不完善的遗传操作工具,未见明显突破.近年来,随着TargeTron基因中断、大片段基因整合等新技术和新方法的出现,其分子遗传改造已取得较大进展.文中对产溶剂梭菌的分子遗传操作工具研究进展进行了总结,并指出了现有技术在效率及全面性方面的不足.基于此,今后应进一步优化现有的梭菌基因失活技术,如建立基于同源重组的基因删除和替换;同时也应发展新的分子操作技术,如基因组多位点共编辑、多拷贝定点和随机整合等.     

实验动物屏障系统利旧改造及环境控制效果分析

对使用年限超过5年的实验动物屏障系统进行利旧改造,并分析改造后的环境控制效果。在原有基础上对实验动物屏障的排风、空调、土建、监控系统等进行了利旧改造,改造后各项环境指标均符合规范要求,且稳定性得到了很好改善,能耗及故障发生频率显著降低。KM小鼠、SD大鼠繁殖性能均有所增强,饲料利用率提高。在实验动物屏障系统改造过程中将利旧、新技术运用与实现微环境控制进行有机结合,使屏障系统长期高效运转并确保实验动物生产质量。     

K2000E发动机燃油系统冷却改造

通过对MT-3600B矿用汽车K2000E发动机燃油泵系统工艺探讨,结合实际工作中不断出现的高怠速问题,总结分析系统故障出现的原因,从而有针对性地改变怠速不稳及高怠等现象,降低运行成本,使矿用汽车能安全可靠的平稳运行。     

果园转型生态公益林防控薇甘菊的生态改造

【背景】深圳大面积果园已转型为生态公益林,但果树被入侵的薇甘菊攀爬覆盖,严重地段已导致群落退行性演替,问题亟待解决。【方法】选取有多种生境的转型果园,分片区开展以植树为核心的生态改造试验,树种以种植后不进行人工除草抚育的血桐、幌伞枫、阴香为主,辅以提高物种多样性为目标的演替中后期树种,均采用袋装大苗于2011年5月种植。【结果】在树冠连续、郁闭的果林片区,所植苗木死亡,林下草本稀少,始终无薇甘菊。在其他非郁闭片区,血桐与幌伞枫生长良好且从未被覆盖;阴香虽于秋冬季被全覆盖但不死亡,次年春新枝穿透覆盖层正常生长;其余种苗木对薇甘菊处于劣势。【结论与意义】郁闭度高的果林片区林下光照弱,能阻止薇甘菊定居,无需人工干预;血桐和幌伞枫分别具抗/耐受薇甘菊覆盖的特性,种后均无需抚育;其余树种则需抚育。因此,掌握各个树种的特性,适地种植、按需精准定株抚育是转型果园低成本、技术简单、一劳永逸地防控薇甘菊生态改造的精髓。在应对有害藤本危害时,勿忽略筛选出不惧该藤本的植物种的可能,在不使用农药、无有效动物或微生物天敌的情况下,它们有可能成为生态安全的防控改造树种。     

再循环抗体的研究进展

单克隆抗体因其与抗原结合具有高度特异性与强亲和力,已成为抗体药物研发的主要类型。但随着天然单克隆抗体的深入研究,它的诸多缺陷也浮出水面,如与抗原结合次数有限、带来非预期的抗体清除效应和抗原累积效应。人们不再局限于天然抗体的筛选,而是想通过改造提升抗体药物的药效。近年来,一类新型再循环抗体的问世,很好地解决了天然单克隆抗体发展的瓶颈。再循环抗体可以在胞外结合抗原,在细胞内与抗原解离,使抗体结合抗原次数最大化,减少抗原介导的抗体清除效应和抗体介导的抗原累积效应,并且再循环抗体可以通过进一步的Fc改造来加强与Fc受体的亲和力。文中综述了再循环抗体的研究进展,包括其特点、改造方法及展望。     

工业环境下酶蛋白的催化行为与适应性改造研究进展

酶在工业上有着广泛应用和巨大潜力,但工业生产中高温、强酸/碱、高盐、有机溶剂和高底物浓度等条件仍然制约着酶的大规模应用。为使酶能更好地在工业环境下发挥催化作用,目前的主要策略是对酶进行适应性改造(如理性或半理性设计、定向进化、固定化等)。文中简要阐述了酶在工业环境下的催化行为以及近年对其适应性改造的研究进展,以期为酶的适应性改造提供参考。