氨基酰化酶中金属锌离子的功能作用

 氨基酰化酶是含锌金属酶。该酶每摩尔蛋白中含2摩尔Zn(Ⅱ)离子。金属鳌合剂与酶作用,通过竞争螯合Zn(Ⅱ)离子使酶活力下降。残余活力与残留金属含量呈正相关。竞争螯合的结果,生成不含金属的脱辅基酶蛋白,并导致酶活力的丧失。脱辅基酶由于加入Zn(Ⅱ)离子而恢复其活力。实验表明金属锌离子是氨基酰化酶催化活力所必需。与Zn(Ⅱ)离子相似,Co(Ⅱ)离子也可与脱辅基酶相结合并使之复活。 在190—240nm区域内对比了天然酶、脱辅基酶蛋白与Co(Ⅱ)置换氨基酰化酶的圆二色谱。远紫外圆二色谱表明,与天然酶相比,在脱辅基酶中由于金属离子的丧失导致主链构象发生变化,其中α螺旋增加约7％。因而锌离子(钴离子)对蛋白主链的反应最适构象有一定的稳定作用。脱辅基酶与Co(Ⅱ)离子结合,酶的主链构象恢复至与天然酶几近相同。可认为这是促使酶复活的内在因素。     

固定化尖镰孢菌细胞的某些酶学特性

尖镰孢菌(Fusariun oxysporum)33—11是一株青霉素V酰化酶的高产菌株。用二醋酸纤维素固定的该菌细胞裂解青霉素V最适的Ph范围为7．4至7.6;最适的反应温度为45℃至48℃;其酶活性受8-羟基喹啉和EDTA的可逆抑制,Mg²⁺、Zn^2-和Mn^2-离子则有激活作用。采用问歇式搅拌裂解青霉素V,测得0．6rnm颗粒度固定化细胞的表观km值为11．7mmol／L。裂解青霉素V的反应活化能为33kJ／mol;底物抑制常数Ks为1950mmol/L;苯氧乙酸和6-APA的抑制常数分别为220mmol／L和270mm0I／L,在裂解反应中．前者是竞争性抑制剂,后者是非竞争性抑制剂。     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

氨基酰化酶在LDS溶液中的失活与去折叠的比较研究

氨基酰化酶在阴离子去污剂十二烷基硫酸溶液中的失活与去折叠的研究结果表明,在低浓度的ＬＤＳ溶液中变性时,以荧光和紫外差吸收方法监测的酶分子构象尚未发生明显变化,而酶的活力已经大部分或几乎全部丧失。当ＬＤＳ浓度达１．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,此时酶分子的构象变化才达到最大程度。在实验使用的ＬＤＳ的浓度范围内,用远紫外ＣＤ光谱监测的二级结构没有发生明显的变化。     

硅藻土在青霉素G酰化酶提纯中的应用

国产硅藻土经氢氧化铵处理后可用于从发酰液中直接取青霉素Ｇ酰化酶,平均吸附量为９０Ｕ／ｇ。吸附的酶可用２２％硫酸铵－０．３ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０）溶液洗脱。平均比１８Ｕ／１８Ｕｍｇ蛋白（ＮＩＰＡＢ法）。硅藻土可反复使用。苯乙酰胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ树脂可对酶作进一步的纯化。     

精胺对牛肝tRNA^lle氨基酰化的刺激作用

本实验用纯化的牛肝异亮氨酸ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ）和异亮氨酰ｔＲＮＡ合成酶,研究了精胺对Ｉｌｅ－ｔＲＮＡ复合物形成及ＩｌｅＲＳ活性的作用。结果表明：精胺能特异地促使牛肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ氨基酰化反应;对ＩｌｅＲＳ活性无影响;能明显地增加形成Ｉｌｅ－ｔＲＮＡ复合物反应的Ｖｍａｘ和ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ的Ｋｍ值。     

非组蛋白巴豆酰化修饰的生物学功能研究进展

赖氨酸巴豆酰化是一种新近发现的蛋白质翻译后修饰类型,在基因表达、细胞代谢及疾病治疗等许多病理生理过程中都具有重要的调节意义,可能是潜在的药物新靶标。目前研究多关注于组蛋白巴豆酰化修饰,而非组蛋白巴豆酰化修饰的研究逐渐被重视。本文简要介绍非组蛋白巴豆酰化修饰的生物学功能及其在疾病中的作用,将有助于了解非组蛋白巴豆酰化修饰的功能和机制。     

湿度和温度对酰化紫膜LB膜M衰减的影响

用闪光动力学光谱仪测量了酰化紫膜ＬＢ膜中Ｍ衰减速率的变化。酰化紫膜ＬＢ膜的衰减无论是悬浮液状态,还是ＬＢ膜中,均比未修饰的要慢。在温度为２０℃时,酰化紫膜ＬＢ随着相对湿度的增加,Ｍ衰减加快。在相对湿度较低时（ＲＨ３４—７５％）,变化较平缓,即Ｍ的衰减加快不明显;在相对湿度较高时（ＲＨ８４—９５％）,Ｍ衰减明显加快。温度的变化则随相对湿度不同而不同。相对湿度较低时,随着温度的升高,Ｍ衰减加快;相对湿度较高时,Ｍ衰减反而减慢。酰化紫膜悬浮液的Ｍ衰减随着温度的升高而明显加快．这说明酰化紫膜ＬＢ膜中ＢＲ水合程度可能是直接影响Ｍ衰减的因素之一。     

高产青霉素酰化酶巨大芽胞杆菌的诱变选育及产酶条件优化

【目的】选育高产青霉素G酰化酶(PGA)工业菌株。【方法】采用LiCl-紫外线复合诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) ATCC 14945进行处理。处理菌体涂平板后,将长出的菌落接种到液体培养基中,向培养6 h后的二代菌液中添加终浓度为0.1%的苯乙酸,28 °C、250 r/min条件下诱导培养40 h。对离心后获得的上清(粗酶液)采用NIPAB法测定PGA酶活力。以PGA酶活力最高的菌株为材料,对苯乙酸最佳添加量和最佳诱导时间进行优化,采用NIPAB法测定PGA酶活力。采用SDS-PAGE检测诱变前后巨大芽胞杆菌粗酶液中PGA的蛋白特性。【结果】从诱变菌落中筛选到PGA酶活力为39.60 U/mL的菌株12-4,酶活力比出发菌株提高了8.5倍。该菌株在液体培养6 h后添加终浓度为0.2%的苯乙酸,继续培养50 h后,PGA酶活力可达78.45 U/mL,比出发菌株提高了16.8倍。诱变前后菌株培养液中的PGA蛋白均具α、β亚基;诱变后菌株PGA α亚基的量没有明显变化,β亚基的量明显增多;α、β亚基之间的蛋白条带明显增多。【结论】采用诱变技术可提高巨大芽胞杆菌PGA活性,获得的诱变菌株12-4及培养条件对PGA工业化生产具有重要价值。     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。