蚯蚓发光体系及其应用研究

发光蚯蚓在世界各地普遍存在。Wampler研究了蚯蚓发光的生理学和生物化学性质。Mulkerrin等还分离纯化了发光蚯蚓的荧光酶,人工合成了荧光素。由于蚯蚓发光体系可用于许多生化分析,因而引起许多学者的注意和兴趣。本文首次报道从我国无锡发现的发光蚯蚓,并从其体液中提取荧光素酶粗提取物,在体外重新组成新的发光体系。研究了这一发光体系的性质,并对蚯蚓发光反应机制和可能应用作了初步探讨。     

固定化虫荧光素酶光纤传感器

固定化虫荧光素酶光纤传感器蔡谨,王顺光,杨歧生,吉鑫松（浙江大学化工系生化教研室,杭州３１００２７;中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词虫荧光素酶,ＡＴＰ,固定化酶,光纤生物传感器ＡＴＰ是生物体内极为重要的能量物质。如何准确快速地定量Ａ...     

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ,该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现,ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区,而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ,ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活,为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

慢病毒介导荧光素酶表达的人鼻咽癌细胞小鼠模型的建立

目的：建立荧光素酶标记的人鼻咽癌细胞裸鼠模型,活体成像系统监测肿瘤的生长并与肿瘤的体积进行对比。方法：构建表达荧光素酶基因2（1uc2）的慢病毒载体,与辅助质粒共转染293T细胞以制备慢病毒,感染人鼻咽癌SUNEl细胞后经嘌呤霉素筛选获得表达luc2的细胞株。活体成像设备体外检测不同数量细胞的发光强度,最后以5×10 6个细胞皮下接种BALB／cnu／nu裸鼠,活体成像系统动态记录接种后肿瘤的信号并与肿瘤的体积对比。结果：成功构建慢病毒表达质粒pLenti．1uc2并包装出慢病毒颗粒,病毒感染后嘌呤霉素筛选6天得到鼻咽癌细胞株SUNEl一luc2。细胞株传代后有稳定的发光强度,且经活体检测的每秒光子数与细胞数成正相关（R2=0．96）;活体成像观察发现裸鼠接种第2天接种部位的发光强度就达到3-2×10^8,而且成瘤过程中发光强度的变化与肿瘤大小一致。结论：成功构建适用于活体成像的人鼻咽癌SUNEl细胞的裸鼠成瘤模型,该模型从细胞接种开始即可有效动态监测鼻咽癌皮下瘤的生长及转移,从而为鼻咽癌的成瘤机制及药物干预研究提供一个新的手段。     

胸窗萤幼虫对灰巴蜗牛的捕食机制初探

本文对胸窗萤Pyrocoelia pectoralis Oliver 4龄幼虫捕食灰巴蜗牛Bradybaena ravida Benson的机制进行了初步探索。通过解剖幼虫消化道进行观察,发现幼虫的食道在与上颚基部骨化结构相连处分为2支,呈Y型结构,分别与2个上颚的中空管道相通;无毒腺结构存在。将幼虫头部及消化道各部分提取液注射到灰巴蜗牛体内后发现中肠提取液对蜗牛的致死效果显著高于头部和消化道其它部分提取液对蜗牛的致死效果(df=68,P<0.05),比较不同浓度中肠提取液对蜗牛致死效果的差异后发现,浓度为5 mg/mL的中肠提取液对蜗牛的致死时间(15.96±4.48)min与幼虫正常捕食的时间(14.47±2.32)min最为相近。     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

拟南芥核酸外切体亚基RRP41L与RRP42及RRP45B的互作关系

在真核生物中,核酸外切体(exosome)是一个由9个核心蛋白亚基组成的在进化上十分保守的大分子复合物,具有加工和降解RNA的重要功能。为了了解影响拟南芥生长发育的核酸外切体亚基RRP41-LIKE (RRP41L)与其他外切体亚基之间的互作关系,本文利用酵母双杂交和荧光素酶互补技术从体外和体内两个方面验证了RRP41L与另外两个核酸外切体亚基RRP42及RRP45B的互作关系。结果显示RRP41L不能与RRP42互作,而能与RRP45B互作。