蚯蚓发光体系及其应用研究

发光蚯蚓在世界各地普遍存在。Wampler研究了蚯蚓发光的生理学和生物化学性质。Mulkerrin等还分离纯化了发光蚯蚓的荧光酶,人工合成了荧光素。由于蚯蚓发光体系可用于许多生化分析,因而引起许多学者的注意和兴趣。本文首次报道从我国无锡发现的发光蚯蚓,并从其体液中提取荧光素酶粗提取物,在体外重新组成新的发光体系。研究了这一发光体系的性质,并对蚯蚓发光反应机制和可能应用作了初步探讨。     

固定化虫荧光素酶光纤传感器

固定化虫荧光素酶光纤传感器蔡谨,王顺光,杨歧生,吉鑫松（浙江大学化工系生化教研室,杭州３１００２７;中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词虫荧光素酶,ＡＴＰ,固定化酶,光纤生物传感器ＡＴＰ是生物体内极为重要的能量物质。如何准确快速地定量Ａ...     

法尼醇X受体激动剂细胞筛选体系的建立与优化

本研究旨在建立一种基于双荧光素酶报告基因检测体系的法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂细胞筛选体系,以满足对FXR激动剂先导化合物的高通量筛选。通过在报告基因质粒pGL4-luc2P-Hygro中的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)基因上游克隆并插入来自FXR靶基因的FXR反应元件(FXR response element,FXRE)片段,构建用于筛选FXR激动剂的报告基因质粒,并结合海肾荧光素酶内参质粒,建立能够有效反映药物对FXR激动效应的双荧光素酶报告基因细胞检测体系。通过一系列优化实验,比较了过表达RXR、鼠源和人源FXR、不同的FXRE片段、FXR过表达质粒与报告基因质粒的混合比对筛选体系诱导效率和灵敏度的影响。根据上述结果,最终确定了优化条件,优化后体系Z因子达到0.83。本研究建立了一种用于FXR激动剂筛选的改良的基于双荧光素酶报告基因检测体系的细胞筛选体系,其主要特征在于,使用多段FXR靶基因上的FXRE片段叠加组成一种新型的增强型FXRE元件,而非传统的反向重复序列-1 (inverted repeats...     

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ,该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现,ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区,而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ,ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活,为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。     

基于寨卡病毒复制子的抗病毒药物筛选系统

寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是引起成人格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)以及胎儿和新生儿小头畸形疾病的重要病原体。有效的抗病毒药物筛选系统是防治ZIKV感染的有效工具。本研究构建了以海肾荧光素酶为检测靶标的寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep,并通过突变NS5蛋白,构建了非复制型寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep NS5△GDD。为了检测复制子的功能,将两种复制子转化至Vero细胞,结果显示随着时间延长, Rluc-ZIKV-Rep荧光素酶活性逐渐增加,寨卡病毒m RNA拷贝数逐渐增多,证明以海肾荧光素酶为检测靶标的寨卡病毒复制子构建成功。为了检测该系统是否能够用于抗病毒药物筛选,用马尼地平和西尼地平两种抗寨卡病毒的药物进行检测,结果显示Rluc-ZIKV-Rep的复制能力随着药物浓度的增加而逐渐降低,呈现一种剂量依赖的方式,说明该系统可以用于抗病毒药物的筛选。综上所述,本研究构建了一种可以用于抗病毒药物筛选的寨卡病毒复制子,为筛选有效的抗病毒药物提供了有力工具。     

一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性 (P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。     

Gaussia分泌型萤光素酶的研究进展及其应用

Gaussia分泌型萤光素酶是近年发现的一种来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps的新型分泌型萤光素酶,是目前已知的可自然分泌的最小萤光素酶,因其分子小、灵敏度高、半衰期短和可高效分泌,而成为一种理想的报告基因,广泛应用于体内外研究。我们就Gaussia分泌型萤光素酶的发光原理、荧光特性及其应用等进行简要综述。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.