无根根零R25和普通变形杆菌P1混合培养发酵L-苹果酸的研究

所筛的41株属于根霉属的菌株,均具有从葡萄糖产生延胡索酸的能力。其中,R25产延胡索酸能力最高,同时产生部分L-苹果酸。该菌株被鉴定为无根根霉(Rhizopus arrhizus)。普通变形杆菌(Protcus vulgaris) Pl具有强的延胡索酸酶活性：可将延胡索酸转化为L一苹果酸。     

用平截末端使大豆根瘤菌苹果酸脱氨酶基因插入失活及电激法转化

本实验用平截末端连接法把卡那霉素抗性基因插入到大豆根瘤菌（Ｂｒａｈｙｒｈ;ｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）１１０的苹果酸脱氢酶（ｍｄｈ）基因中,致使ｍｄｈ基因失活,再通过电激法把这一重组基因转入大豆根瘤菌（Ｂｒａｈｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）２１４３中,进而探讨ｍｄｈ基因失活对大豆固氮作用的影响。     

L-苹果酸产生菌筛选及高产突变株诱变选育

通过广泛收集和分离,获得根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)及裂褶菌属(Schizophyllum)等属菌株897株。产酸指示平板上的变色圈测定结果表明,它们中间628株为产酸菌。通过纸层析对产酸菌发酵液酸谱的分析,获得129株L-苹果酸产生菌,经进一步测定发酵液中L-苹果酸的含量,筛选出以葡萄糖为原料,摇瓶发酵140小时,L-苹果酸产率48．37g／L,对糖转化率48．37×10^-2 的菌株LMO2。经初步鉴定,这一菌株为曲霉(Asper-gillus sp.)以LM02作为出发株,采用亚硝基胍、自然污染细菌、甲基磺酸乙酯及紫外线进行诱变处理,选育出葡萄糖为原料,L-苹果酸产率较高的突变抹N1-14、N1-14、NE1412、NU1416及NU1419。其中N1-14 的L-苹果酸产量最高,比出发株提高46．2×10^-2。N1-14 的菌丝生长速度快,产孢能力强,摇瓶发酵葡萄糖140小时,平均L-苹果酸产率为72．53g／L,对糖转化率53．74×10^-2。全发酵液经薄层层析测定,不含黄曲霉毒素。发酵产物分离提纯后,得到白色粉末状结晶,经纸层析、质谱及红外光谱测定,证明为L-苹果酸。     

大肠杆菌苹果酸合酶A的酶学和生理功能研究

苹果酸合酶是乙醛酸循环的关键酶之一。E.coli中苹果酸合酶A(malate synthase A,MSA)由aceB基因编码。根据E.coli基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增aceB基因,并将其克隆入pET-29b(+),构建了重组表达质粒pET-MSA。经IPTG诱导,MSA在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达。纯化的MSA蛋白的分子量大小约为60 kDa,最适反应pH值和最适温度分别是pH值8.0、30℃。纯化的蛋白质在Mg2+存在时才能发挥最大的活性,其对乙酰辅酶A的Km和Vmax分别是8.07μM和3.6μM/min。此外构建了MSA和苹果酸合酶G(MSG)基因敲除菌株MG::ΔaceB和MG::ΔaceBΔglcB。研究发现缺少MSA的E.coli突变菌株在乙酸中的生长速率要比野生型菌株慢很多,表明MSA对大肠杆菌在乙酸中的生长起着重要作用。MSG虽然能部分补偿MSA的作用,但是包含MSA的乙醛酸旁路是更有效的乙醛酸代谢途径。     

聚苹果酸生产菌出芽短梗霉CCTCC M2012223的全基因组测序及序列分析

【目的】解析出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组序列信息,分析其代谢产物聚苹果酸、黑色素、普鲁兰多糖合成相关基因,为深入研究遗传多样性和代谢工程改造提供序列背景信息。【方法】使用Illumina Hi Seq高通量测序平台对出芽短梗霉CCTCC M2012223菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行序列拼接,基因预测与功能注释,COG/GO聚类分析,比较基因组学分析等。下载其他5株出芽短梗霉基因组序列,比较分析6株菌的种内同源基因、全基因组进化以及代谢产物合成相关基因。【结果】出芽短梗霉CCTCC M2012223基因组序列全长30756831 bp,GC含量47.49%,编码9452个基因。比较基因组分析表明出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组组装长度最长,6株菌的同源基因数达到7092个,普鲁兰多糖和聚苹果酸合成相关基因的蛋白序列有很高的保守性。出芽短梗霉CCTCC M2012223和Aureobasidium pullulans var.melanogenum亲缘关系最近,而这2株菌的黑色素合成相关基因的蛋白序列有一些插入和突变。【结论】本研究解析了出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组序列信息,获得黑色素、普鲁兰多糖和聚苹果酸合成相关基因,为后续的代谢机制解析和改造提供相关依据。     

聚苹果酸合成新方法及其聚苹果酸苄基酯用作药物载体的研究

目的:优化β-聚苹果酸(PMLA)的合成路线,制备部分氢化的聚苹果酸苄基酯(PMLABz),为构建载药纳米胶束提供两亲性聚合物载体。方法:分别以L-天冬氨酸和L-苹果酸为原料,合成单体β-苄氧羰基-β-丙内酯,再通过阴离子开环聚合制备PMLABz,最终氢化制备PMLA。X射线衍射仪、差示扫描量热仪等对材料的性质进行表征,L929成纤维细胞测定聚合物的细胞毒性,透析法制备部分氢化的聚苹果酸苄基酯空白胶束。结果:通过优化反应条件,以L-苹果酸为原料合成关键中间体β-苄氧羰基-β-丙内酯的终产率为31.5%,对比文献报道的L-天冬氨酸合成路线,产率提高近7倍。X-RD结果表明以L-苹果酸为原料制备的PMLABz有明显的衍射峰,结晶度高,熔点随之升高,MTT实验证实PMLABz无毒性。部分氢化的PMLABz可在水中自组装成一定粒径的胶束,氢化77%的PMLABz可得到粒径均匀、形态良好的纳米胶束。结论:分别以L-天冬氨酸和L-苹果酸为原料合成聚苹果酸,优化合成路线,提高终产率,得到了新晶型PMLABz,并通过部分氢化PMLABz制备两亲性聚合物进而得到纳米胶束,为后期纳米释药体系研究提供优良载体。     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergilluswentii)A     

Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。