蜚蠊灭菌肽的诱导及初步分离分析

昆虫经诱导盾产生灭菌肽的研究近年来已有很大进展,有关这方面的研究工作绝大多数都是以有翅亚纲内生翅类鳞翅目(主要是蚕类)昆虫和少数双翅目昆虫为材料.本文首次以有翅亚纲外生翅类蜚蠊目的美洲蜚蠊(Ptriplaneta americana L.)为实验昆虫,用Escherichia coil K₁₂ strain D₃₁作诱导源,对不同发育期、不同性别、不同成虫期的蜚蠊进行诱导后,采用含菌培养基平板测活方法,就存在个体数及能产生抗菌物质的个体数进行了初步的研究.发现成虫日龄在10天之内的雄性蜚蠊能够产生抗菌物质的个体百分比最高.抗菌物质出现的高峰期是在诱导后第三、四天.用滴滴涕和溴氰菊酯作诱导源对雄性蜚蠊的诱导实验表明,杀虫剂也能诱导蜚蠊产生抗菌物质,而且所诱导产生抗菌物质的活性强度(用抑菌圈直径表示)高于大肠杆菌所诱导的.滴滴涕和溴氰菊酯的重复诱导可提高蜚蠊产生抗菌物质个体百分比.蜚蠊经诱导后产生的抗菌物质具有广谱性,对苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及绿脓杆菌等有较强的抗菌活性,而对大肠杆菌D₃₁、大肠杆菌、粘质沙雷氏杆菌和溶壁微球菌等有较弱的抗菌活性.用肽类物质的指纹图谱法分离蜚蠊血淋巴抗菌物质,发现经诱导后血淋巴中确有新的肽类物质产生,该物质具抗菌活性,用DABITC法分析,其N-末端氨基酸为赖氨酸.     

呲虫啉、杀虫双对美洲蜚蠊中枢神经的电生理影响

本文运用美洲蜚蠊(Periplaneta americana)第V1腹神经节突触后电位细胞外记录方法研究了吡虫啉、杀虫双对中枢神经活动的影响。结果显示：1.73x10^-7mol/L吡虫啉和 1.38XlO^-5Stool/L杀虫双处理后初期均能引起自发性突触后电位发放增强,随后导致突触传递阻断。而吡虫啉较杀虫双阻断传递快,且用Ringer生理溶液冲洗不易恢复,表明吡虫啉较杀虫双激动剂活性更强。以3.37×10^-5mol/L甲胺磷预处理中枢神经样品后,再进行杀虫双处理,则突触后电位的发放频率和幅值有明显增强,产生连续超幅排放(overshooting)现象,相反,甲胺磷预处理对随后进行吡虫啉处理无明显影响。这些结果说明,吡虫啉、杀虫双和乙酰胆碱受体发生相互作用过程存在差异。     

杨树新品种叶肉原生质体培养和植株再生

从１ 个月龄的ＮＬ－８０１０６ 杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｄｅｌｔｏｉｄｅｓ×Ｐ． ｓｉｍ ｏｎｉｉ）无菌苗叶片分离得到大量原生质体,纯化后其原生质体产量为４×１０７／ｇ ｆｒ．ｗ ｔ． 纯化的原生质体在含２,４－Ｄ ２ ｍ ｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．５ ｍ ｇ／Ｌ和ＫＴ ０．５ ｍ ｇ／Ｌ的ＫＭ８ｐ 和ＭＳ培养基中进行高密度液体浅层培养,渗透势为０．４０ ｍ ｏｌ／Ｌ的ＫＭ８ｐ 培养基中原生质体分裂频率最高． 培养第５ 天观察到第一次细胞分裂,培养１０ ｄ 的分裂频率为４．５％ ,１２ 周内可形成大量的细胞团和小愈伤组织． ＮＬ－８０１０６杨叶肉原生质体在富含有机氮并以葡萄糖为碳源的培养基中具有较高的分裂频率和植板率．小愈伤组织在ｇｅｌｒｉｔｅ 固化的ＮＬＺ１ 培养基上增殖生长,３ 周后形成４—６ ｍ ｍ 结构紧密的鲜红色愈伤组织,转至ＮＬＦ分化培养基,分化成苗率为１００％ ． 待芽伸长到３ ｃｍ 时,从基部切下转至１／２ ＭＳ培养基上诱导生根,形成完整植株     

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。     

野牛平腹吸虫虫卵和尾蚴的扫描电镜初步观察

近年来随着电镜技术的发展,寄生虫超微结构方面的研究资料已相当丰富,但有关同盘类吸虫蚴期超微结构的资料尚未见报道。我们于1988—1989年在野牛平腹吸虫的生活史研究(另文发表)的同时,对本虫虫卵和成熟尾蚴进行了扫描电镜观察。     

美洲斑潜蝇自然种群的生态控制研究

应用作用因子生命表方法以及在此基础上提出的干扰作用控制指数法评价了不同的生态控制措施（施用马缨丹Lantana camara L．乙醇提取物、施用机油乳剂和释放寄生性天敌）对美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard种群动态控制的作用,结果表明,在喷施马缨丹乙醇提取物（浓度为1gDW／100mL）和机油乳剂（300x）,释放寄生性天敌各处理区中的干扰作用控制指数分别为0．176、0．252、和0．377,表明这几种控制措施对美洲斑潜蝇的种群数量具有明显的控制作用,对美洲斑潜蝇种群的控制效果分别为82．4％、74．8％和62．3％。在此基础上,建立了美洲斑潜蝇自然种群的生态控制系统,在田间评价了自然控制因子与人工控制措施联合对美洲斑潜蝇种群的控制作用,结果表明,在美洲斑潜蝇成虫产卵高峰期施用马缨丹乙醇提取物（1gDW／100mL）和机油乳剂（300x）,在幼虫高峰期释放寄生蜂（2000头／100m^2）,处理后美洲斑潜蝇的种群趋势指数I值小于1,表明可以达到控制美洲斑潜蝇种群增长的效果。     

基于SSR分子标记构建南方型美洲黑杨初级核心种质

以所收集的363份美洲黑杨无性系为实验材料,利用20对SSR引物扩增数据,设置10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%共7个取样梯度构建南方型美洲黑杨初级核心种质,并采用平均观察等位基因数(Na)等遗传参数的t检验对核心种质有效性进行确认,以初级核心种质、保留种质以及原始种质三者之间平均观察等位基因数(Na)等遗传参数的保留比例作为评价指标,结合主坐标轴分析法对初级核心种质做进一步代表性确认。结果显示:(1)20对SSR引物共检测到278个多态位点,遗传多样性参数I、H分别为1.667和0.688 2,表明南方型美洲黑杨种质资源具有丰富的遗传变异。(2)比较平均Na、I、H变化确定15%为最佳取样比例,得到54份核心种质和309份保留种质,构建的初级核心种质与原始种质的平均Na、I、H经t检验不显着,除平均Na外其他平均遗传多样性参数,如Ne、Ho、I、H的保留率分别为111%、105%、104%和104%。(3)PCoA分析显示,所构建的初级核心种质不仅与原始种质分布相似,而且分散均匀覆盖较全面,可以代表原始种质在图中的几何分布。研究认为,所构建的45份初级核心种质保存了原始种质大部分的等位基因和基因型,剔除了原始种质的遗传冗余度和遗传重复度,具有更高的遗传多样性参数保留率,能全面代表原始种质的遗传多样性。     

商陆根中抗真菌蛋白的分离和特性研究

从美洲商陆(Phytolacca americana L.)夏天采集的2—4年生宿根中分离了二种抗真菌蛋白,称为PAFP-R_1和PAFP-R_2。分离程序包括用盐溶液提取,经CM-Sephadex离子交换层析、凝胶过滤层析和羟基磷灰石柱层析纯化。在PGA培养基上,0.1mg/ml蛋白明显抑制木霉菌丝的生长;但对细菌的增殖,即使1mg/ml也无抑制作用。用SDS-PAGE测得二者的相对分子量各为13kD和15kD,单多肽链,等电点约为5.8。用酚-硫酸法未测出含糖。二种蛋白均高含半胱氨酸(19mol/mol)。用Edman降解法测得二者的N末端均为Ala。秋天采集的根中,这二种蛋白含量均很低,但富含由二条PAFP-R_1肽链以双硫键联结的二聚体,它无抗真菌活性。冬天宿根中抗真菌蛋白主要成分是Mr为17kD的单肽链蛋白。上述蛋白对于人红血球均无凝集活性,因此不是PWM的成分。以上结果说明,商陆根中有多种具抗真菌活性的蛋白,成分随季节发生变化,它们都是不含糖,高含半胱氨酸,分子量小于20kD的单肽链蛋白。     

美洲大蠊基因组重复序列分析

重复序列是真核生物基因组的重要组成部分。一些重复序列,如自主型的逆转录转座子LINE,在昆虫的系统进化和遗传多样性研究方面得到了广泛的应用。de novo从头预测和基于同源比对预测相结合的方法被用来搜索美洲大蠊Periplaneta americana基因组,共鉴定出大约占全基因组62%的重复序列。研究发现,散在重复序列中,DNA转座子占美洲大蠊基因组的16.18%;逆转座元件中LINE最多,占基因组的13.64%,SINE和LTR分别占基因组的3.52%和1.32%。LINEs中的Bov Bs亚家族在所有转座子亚家族中比例最高(约6.73%)。美洲大蠊与德国小蠊Blattella germanica相比,除LTR外,其他类型的转座子占基因组的比例均高于德国小蠊。通过分析逆转录转座子反转录酶完整度、氨基酸序列相似度及遗传距离,从美洲大蠊基因组中鉴定出一类BovBs:RTE-1_PAm。BovBs的反转录酶氨基酸序列的系统树表明,美洲大蠊与内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis的进化关系比与其同属蜚蠊科Blattidae的德国小蠊的关系更近。昆虫中BovBs的进化关系与传统核基因进化关系的不同,表明转座子的进化相对宿主基因的进化具有一定的独立性。