精制白喉毒素加β—丙氨酸后脱毒效果观察

精制白喉毒素加０．０２Ｍβ—丙氨酸,再加甲醛溶液经适当的时间解毒,即可转化为完全类毒化且无毒性逆转的精制白喉类毒素。此精白类的脱毒试验、毒性逆转试验、安全试验及效力试验均符合《中国生物制品规程》要求。在脱毒过程中絮状单位的损失明显低于单纯甲醛脱毒者,纯度亦相应得到了提高。     

白喉毒素／IL—6的高效表达及细胞毒作用的研究

白喉毒素是由携带β噬菌体基因组的白喉杆菌产生的由５３５个氨基酸组成的单链外毒素,毒性极强,１￣２个分子即可灭活１个真核细胞,肿瘤细胞对它尤为敏感。在骨髓瘤、原发性肝癌等肿瘤细胞表面,ＩＬ－６受体可过度表达,利用受体与配体的特异性结合,可将细胞毒性药物定向导入肿瘤细胞。基于上述理论,用ＩＬ－６ｃＤＮＡ取代白喉毒素的受体结合区,构建了白喉毒素／ＩＬ－６融合蛋白表达载体ｐΔＤＴ／ＩＬ－６。ＩＰＴＧ诱导后     

白喉毒素类免疫毒素研究进展

白喉毒素类免疫毒素是将缺失天然受体结合活性的白喉毒素片段或突变体与抗体或细胞因子偶联而得到的一类新型导向药物,它可特异性识别并结合靶细胞,通过发挥其ADP核糖基化活性而抑制细胞蛋白合成,引发细胞凋亡。由于白喉毒素类免疫毒素能高效、特异地杀伤特定靶细胞,而使其在肿瘤等疾病的药物开发中暂露头角。综述了基于白喉毒素的免疫毒素的研制现状与应用前景 。     

紫外分光光度法测定白喉毒素无毒突变体CRM197的蛋白含量

目的 基于紫外分光光度法,建立一种测定白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白含量的方法。方法 在天然折叠状态和非折叠状态(CRM197蛋白经盐酸胍变性)下,分别测定相同含量的CRM197蛋白A_{280 nm}值,再根据朗伯-比尔定律c=A/εL计算其折叠状态消光系数。同时,使用当前建立的方法与BCA法分别测定CRM197蛋白的含量,并对2种方法的差异和检测特点进行比较分析。结果 根据CRM197蛋白的氨基酸一级序列与相对分子质量计算出其理论消光系数为0.934 mL/(mg·cm),在280 nm处的实验消光系数为(0.959±0.006)mL/(mg·cm)。2种方法测定同一蛋白样本的结果一致,分别为(2.17±0.02) mg/mL和(2.14±0.09)mg/mL;本方法检测值的CV为0.70%,BCA法检测值的CV为4.15%。结论 本研究建立的CRM197蛋白含量测定方法准确性高、线性范围宽、获取数据快,可用于CRM197蛋白含量的测定,同时为其他载体蛋白的含量测定提供了参考。     

精制白喉毒素脱毒工艺的改进

为了改进精制白喉毒素脱毒工艺中存在的时间长和损失大等问题,我们考虑进行脱毒过程中加入Ｌ－赖氨酸协同脱毒的试验,并以原工艺进行比较,结果使原工艺存在的问题均得到较好的解决。     

白喉毒素E154位突变及生物活性评价

在量子化学计算的基础上,结合目前关于白喉毒素结构与功能的研究状况,选择把白喉毒素催化区的第154位谷氨酸分别突变为天冬氨酸和精氨酸,研究此处电荷性质的改变对生物活性的影响.通过基因定点突变方法制备这两个突变体基因,并在大肠杆菌表达系统中获得高效表达,在此基础上对它们的生物活性进行了评价.结果表明,与重组野生型白喉毒素相比,突变体E154D的整体动物毒性和细胞毒性略有增加,而E154R的毒性下降.     

新构建的含DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体对人乳腺癌细胞的特异性杀伤作用

目的研究新构建的含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体PGL3-DF3-DTA对人乳腺癌细胞的影响。方法构建重组表达载体PGL3-DF3-DTA,并用其转染DF3阳性和阴性的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。通过MTT法测定PGL3-DF3-DTA在体外对乳腺癌细胞生长的影响,建立裸鼠动物模型观察PGL3-DF3-DTA在体内对乳腺癌细胞的杀伤效应。结果成功构建出重组表达载体PGL3-DF3-DTA并建立了人乳腺癌裸鼠动物模型,经重组表达载体PGL3-DF3-DTA作用后的DF3阳性人乳腺癌细胞出现明显的凋亡现象,Ki-67、bcl-2基因表达水平降低,bax基因表达水平升高。结论重组表达载体PGL3-DF3-DTA能对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用。     

反相高效液相色谱法检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度

目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度。方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统,以含0.1%三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度,并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察。用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度。结果 建立的方法系统适用性良好;专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰,热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度>1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为...     

抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达

目的：构建重组DTA—hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法：通过PCR扩增,获得只含白喉毒素（DT）活性部位（DTA）的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,经SDS—PAGE和Western印迹分析鉴定。结果：酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS—PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA—hS-20融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23％,表达形式主要为包涵体。结论：构建了DTA—hS-20重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。