核糖体基因区打靶载体电转染肝细胞的孵育条件的优化

目的:提高核糖体基因区打靶载体的转染效率,优化其电转染肝细胞的孵育条件.方法:在其它电转染参数一致的前提下,设计了6组不同的孵育条件,通过分析转染后细胞活率以及48h后目的基因GFP的表达效率,来比较多组不同的孵育条件对电转染效率的影响.结果:6组条件中,转染前21℃,1min,转染后21℃,1min孵育,得到的转染效率最优,比其它的条件得到的转染效率高50%.结论:孵育条件的优化能提高为核糖体基因区靶向表达我体在体外电转染肝细胞的转染效率.     

大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:将大鼠低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因转染到骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),为后续基因修饰的BMSCs移植治疗脊髓缺血再灌注损伤提供必要的理论依据.方法:采用直接贴壁法分离,传代培养出纯化的大鼠BMSCs;用电穿孔的方法将构建好的大鼠HIF-1α基因表达栽体转染入BMSCs中;通过免疫细胞化学法,鉴定HIF-1α能否成功转染进入BMSCs;RT-PCR检测转染前后HIF-1α在细胞中的表达效果.结果:直接贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMSCs;免疫细胞化学法显示转染后BMSCs内充满蓝紫色深染颗粒;RT-PCR结果显示,转染后细胞内HIF-1α基因表达量明显增高.结论:大鼠HIF-1α基因通过电穿孔方法可成功转染到符合试验标准的BMSCs中,并且稳定表达,为进一步研究修饰后HIF-1α基因对BMSCs增殖带来的影响以及治疗相关疾病等方面奠定基础.     

活化／抑制CD59对T淋巴细胞增殖的影响

目的：研究活化／抑制cD59分子对T细胞增殖的影响。方法：Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59质粒及用CD59活化抗体刺激。激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及cD59分子在细胞膜上的分布及表达;MTT比色法检测细胞的增殖。Westernblot检测CD59分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平。结果：激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿色荧光,转染效率约为40％。转染pSUPER-siCD59质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat细胞分布一致。抗体活化后CD59在细胞膜成簇状分布。抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70的蛋白表达水平均高于正常组（P〈0．05）,而细胞电转质粒后则恰恰相反。结论：CD59通过与信号转导分子的相互作用促进T细胞活化增殖。     

电转染哺乳类动物细胞DG44-CHO的方法探讨

目的：建立并验证DG44-CHO细胞快速、无血清培养体系的转染方法。方法：将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1电转入DG44-CHO细胞,用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达量;将不同重组蛋白表达质粒C1—28／GL1／pCMV163、C1-28／GL2／pCMV163和TmHL／pCMV163分别电转入DGd4-CHO细胞,ELISA检测其培养上清中相应重组蛋白的表达。结果：280V电压电击20ms、质粒用量为20pg时,转染细胞中绿色荧光蛋白的表达量最高;同样在该条件下,培养上清中重组蛋白浓度最高。结论：上述电转染条件具有一定的适用性。     

不同日龄大鼠颈上交感神经节神经元电转染方法

目的 建立一种高效电转染不同日龄大鼠颈上交感神经节(superior cervical sympathetic ganglion,SCG)神经元细胞的方法.提高转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率.方法 用传统的及经改良的神经元培养液分别培养电转染后的7日龄、14日龄和40日龄SD大鼠SCG细胞,24 h后用台盼蓝染色方法观察并计算细胞成活率;通过改变质粒DNA和siRNA与转染液比例,优化转染条件,于转染24h后在共聚焦显微镜下观察并计算转染效率或干扰效率.结果 改良培养液可使14日龄以上SD大鼠SCG细胞转染后成活率达到75％以上,明显高于传统培养液转染后的成活率(P＜0.01),且结果稳定,细胞状态良好,能够满足后续实验研究的要求;优化转染条件后,DNA 的转染率及siRNA的干扰率显著提高,当DNA与转染液比例为1∶100(μg∶μL)时,细胞转染率最高;当siRNA与转染液比例为1∶50(μg∶ μL)时干扰率最高.结论 通过改良神经元培养液及优化转染条件,成功提高了电转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率,利用电转染方法可成功转染不同日龄SD大鼠SCG神经元.     

小鼠骨样细胞MLO-Y4转染方法的研究

为了建立质粒转染小鼠骨样细胞MLO-Y4的方法,分别采用阳离子脂质体法和电转染法将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒pEGFP-C1转染小鼠骨样细胞MLO-Y4,正常培养48h后检测并统计转染率和死亡率。结果显示,脂质体法转染,当质粒与脂质体比例为1∶4时,转染效率可达到（36.8±3.7）%,细胞死亡率为（18.4±1.9）%;电转染法转染,脉冲电压240 V,脉冲时间300μs,脉冲次数3次时,转染率最高,可达到（23.8±2.3）%,细胞死亡率为（14.1±1.1）%。而后MTT实验显示脂质体转染法相对于电转染法对MLO-Y4细胞的增殖有一定的抑制作用,但对后续实验研究影响不大。脂质体转染法转染小鼠骨样细胞MLO-Y4优于电转染法。     

利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7EⅠ酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞。该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点。同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路。     

不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对猪胎儿成纤维细胞转染效率的影响

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector? 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM^? 830、NEPA 21和Nucleofector? 2b中的转染效率。结果显示：NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector? 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM^? 830和Nucleofector? 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8 μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector? 2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。     

绒山羊细菌人工染色体重组及细胞转染系统

绒山羊(Cashmere goat)是一类以生产山羊绒为主的山羊品种,因其绒毛纤细有光泽、轻盈、保暖而备受青睐。绒山羊角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein,KAP)和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)在羊绒纤维毛囊细胞的增殖和分化过程中起重要作用。为了提高山羊绒的产量和品质,对包含kap6.3,kap8.1和bmp4基因的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)进行研究。首先采用同源重组的方法对BAC进行修饰,其次将哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子加入BAC中,最后采用Amaxa Nucleofector核转染技术将修饰过的BAC转入绒山羊成纤维细胞。结果表明成功构建了含有目的基因的BAC-Tol2载体。载体上包含UBC启动元件的egfp标记基因和真核筛选抗性neo基因,并且载体的两端加有loxp元件,为转染细胞后标记和抗性基因的去除作准备。载体转染细胞效率达到1%-6%,最高可达10%。成功获得了外源整合kap6.3、kap8.1和bmp4基因的细胞株,为以后克隆绒山羊作准备。研究表明,在BAC的修饰中应用Tol2转座子系统增加了电转染后的整合率,提高了BAC无错重组的效率和精确性。     

电转染效率影响因素的探讨

目的:探讨影响电转染效率的因素。方法:将CHO细胞和DNA(携带标志基因的质粒)混和后进行电转染,观察电转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率影响。结果:孵育温度不影响细胞的存活率,而影响基因的转染效率;电转染前后低渗条件有利于电转染;延长电转染持续时间和频率而不加大电压有利于电转染;最好选用处于G2/M期的细胞进行电转染。结论:初步认为温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率有一定的影响。